Principios de análisis instrumental

el ion dipolar de la glicina es más fuerte como ácido que como base. Por tanto, una disolución acuosa de glicina tendrá cierto carácter ácido. El zwitterión de un aminoácido presenta carga tanto posi– tiva como negativa y no tiene tendencia a migrar en el seno de un campo eléctrico, pero las especies catiónicas y aniónicas mono– cargadas son atraídas por los electrodos de carga opuesta. No se produce migración neta de un aminoácido en un campo eléctrico si el pH del disolvente es tal que las concentraciones de las formas aniónicas y catiónicas son idénticas. El pH al cual no se produce migración neta se denomina punto isoeléctrico (pi) y es una cons– tante física muy importante para la caracterización de los aminoá– cidos. El punto isoeléctrico está relacionado con las constantes de ionización de las especies. Entonces, para la glicina en el punto isoeléctrico, [NH 2 CH 2 COO-] = [NH/ CH 2 COOH] Si se divide Ka entre Kb y se sustituye esta igualdad, se obtiene en el punto isoeléctrico: [H30 +];,o [OH- ];, 0 (30.10) Si se sustituye K,/[H 30 +];, 0 por [OH- ];, 0 en la ecuación 30.10 y se reordena la ecuación, se tiene [ +] -#•Kw H30 iso- Kb (30.11) Es posible transformar la ecuación 30.11 en el pH del punto isoeléctrico (pi) al calcular el logaritmo negativo en ambos miem– bros. Entonces, el pi se puede expresar como = _ +] = ( -logK. - logKw + logKb) pi log [H 30 iso 2 (pK. + pKw- pKb) pi = _:__--=.___.::..___ 2 (30.12) En el caso de la glicina, pK. = -log(2 X 10- 10 ) = 9.7, pKb = 11.7 y pKw = 14.0. Por tanto, pi = (9.7 + 14.0 - 11.7)/2 = 6.0 De aquí que el punto isoeléctrico pi de la glicina se produce a un pH de 6.0. Separación de especies anfóteras Las separaciones isoeléctricas de especies anfóteras se llevan a cabo en una mezcla de disoluciones amortiguadoras cuyo pH varía de manera continua. Este gradiente de pH se prepara a par– tir de una mezcla de diferentes anfolitos en disolución acuosa. Por lo regular, los anfolitos son compuestos anfóteros que contienen grupos carboxílicos y grupos amino. Las mezclas de anfolitos que abarcan diferentes intervalos de pH se pueden preparar o se com– pran listas para usar. Para llevar a cabo un experimento de enfoque isoeléctrico en un tubo capilar, la mezcla del analito se disuelve en una disolu– ción diluida de los anfolitos, la cual se transfiere entonces a un tubo. Uno de los extremos del capilar se introduce en una diso– lución de una base fuerte, por ejemplo, hidróxido de sodio, en la cual se aloja también el cátodo. El otro extremo del capilar se sumerge en una disolución de un ácido fuerte, por ejemplo, ácido ))) 30( Aplicaciones de la electroforesis capilar 787 fosfórico, en la cual está también el ánodo. Cuando se aplica el campo eléctrico, los iones hidrógeno empiezan a migrar desde el compartimiento del ánodo hasta el cátodo. Los iones hidróxido procedentes del cátodo comienzan a desplazarse en sentido con– trario. Si alguno de los componentes del anfolito o del analito tiene carga neta negativa, migra hacia el ánodo positivo. Durante esta migración la especie atraviesa regiones de pH menor, donde se produce su protonación progresiva, lo cual hace descender su carga negativa. En un determinado momento, la especie alcanza un valor de pH donde su carga neta es cero (su punto isoeléc– trico) . En ese momento termina su migración. Cada una de las especies del anfolito pasa por este proceso y finalmente da lugar a un gradiente continuo de pH a lo largo del capilar. Los iones del analito también migran hasta alcanzar su punto isoeléctrico. Estos procesos dan como resultado la separación de los analitos en bandas estrechas situadas en el valor de pH correspondiente a su punto isoeléctrico (véase la figura 30.8c). Se consigue un enfoque muy nítido en tales sistemas. Observe que las separaciones por enfoque isoeléctrico se basan en las diferencias entre las propieda– des de equilibrio de los analitos (K., Kb) y no en las diferencias en las velocidades de migración. Una vez que cada analito llega a la región donde es neutro, las posiciones de las bandas se mantienen constantes y no cambian con el tiempo. Movilización de las bandas enfocadas Para detectar las bandas enfocadas en una separación por enfoque isoeléctrico capilar, es necesario desplazar o movilizar el contenido del capilar de tal manera que las bandas lleguen al detector situado en un extremo. La movilización se logra al aplicar una diferencia de presión, de la misma manera que se hace para cargar la muestra o simplemente mediante el cambio de la disolución del comparti– miento del electrodo. Durante el proceso de enfoque entra igual número de H+ que de OH- por los extremos opuestos del capilar, por lo que el gradiente de pH se mantiene estable. Suponga que se añade cloruro de sodio a la disolución de hidróxido de sodio después de haber finalizado el enfoque. En estas condiciones, tanto los iones Cl- como los OH- migran hacia el extremo del cátodo de la columna y la suma de estas dos concentraciones se equilibra con los H+ que penetran por el extremo opuesto. Entonces, ahora hay menos OH- que H+ fluyendo hacia el interior del capilar. El pH desciende en el extremo del cátodo y el gradiente de pH deja de ser estable; se mueve hacia el extremo del cátodo junto con todas las bandas enfocadas. Las bandas que pasan primero por el detector son las que corresponden a las proteínas cuyos puntos isoeléctri– cos son más alcalinos. En la figura 30.13 se muestra el electrofe– rograma correspondiente a la separación de marcadores de pi de baja masa molecular (A) y una mezcla de tres proteínas (B) . En este caso, la movilización se llevó a cabo por electroósmosis. 30C.5 Cromatografia micelar electrocinética En 1984, Terabe y sus colaboradores 15 describieron una modifica– ción de la electroforesis capilar con la que se podía separar feno- 15 S. Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya y T. Ando, Anal. Chem., 1984,56, p. 111, DOI: 10.1021/ac00265a031; S. Terabe, K. Otsuka y T. Ando, Anal. Chem., 1985,57, p. 834, DOI: 10.1021/ac0028 la014.