Principios de análisis instrumental

786 Capítulo 30 Electroforesis capilar, electrocromatografía capilar y fraccionamiento por flujo y campo <« electroforético, los fragmentos de masa molecular baja se mueven con mayor rapidez y llegan al detector antes que los fragmentos de masa molecular más alta. El orden de las bases en el ADN se determina mediante la sucesión de colores de los fragmentos eluidos. Se usan rayos láser para excitar la fluorescencia de la tinción. Se han descrito varias técnicas diferentes para detectar la fluorescencia. En un método se utiliza un sistema de barrido en el cual el conjunto de capilares se desplaza en relación con el rayo láser de excitación y un sistema de detección de cuatro longitudes de onda. La región que ilumina el rayo láser se despliega como imagen en un detector de dispo– sitivos de acoplamiento de carga (CCD) (véase la sección 7E.3). Los filtros facilitan la selección de longitud de onda para detectar los cuatro colores. Se ha reportado la separación simultánea de fragmentos de ADN en 100 capilares. 12 En otros diseños se ins– talan sistemas detectores de flujo con cubierta y un detector con dos rayos láser de diodos para la excitación. Los instrumentos comerciales cuestan entre 90 000 y más de 1000 000 de dólares. 13 Los secuenciadores de ADN y otros tipos de analizadores con aplicaciones en genética ya se fabrican en miniatura utilizando tecnología de microchips que pueden utilizarse en cualquier laboratorio. 14 La electroforesis capilar desempeñó un papel muy importante en la identificación de restos humanos en el desastre del World Trade Center. 30C.3 Isotacoforesis capilar En esta técnica, las bandas de todos los analitos migran en última instancia a la misma velocidad; por eso recibe el nombre de iso, igual, y taco, velocidad. En cualquier aplicación concreta, los catio– nes o los aniones pueden ser separados, pero no al mismo tiempo. En una separación por isotacoforesis, la muestra se inyecta entre dos disoluciones amortiguadoras, a saber, la de entrada, que con– tiene iones con mayor movilidad que cualquiera de los iones del analito, y la de salida, en la que van iones de menor movilidad que los iones de la muestra (figura 30.8b). Por ejemplo, en las separacio– nes de aniones, los iones cloruro van en la disolución amortigua– dora de entrada, y los iones de heptanoato de movilidad más lenta van en la disolución amortiguadora de salida. Para las separacio– nes de aniones, la disolución del electrolito de entrada se conecta al ánodo y la disolución amortiguadora de salida se conecta al cátodo. Cuando se aplica primero el campo eléctrico en una sepa– ración por isotacoforesis, los iones del analito migran como en la electroforesis de zona, cada ion a su propia velocidad, la cual viene dada por el producto de !LeE. Esta diferencia en las velocida– des de migración da como resultado la separación de los distintos analitos en bandas adyacentes; la especie más rápida está situada en la banda más próxima a la de la disolución amortiguadora de entrada y la más lenta después de la disolución amortiguadora de salida. Una vez que se han formado las bandas, todas se mue- 12 K. Ueno y E. S. Yeung, Anal. Chem. , 1994,66, p. 1424, DO!: 10.1021/ac00081a010. 13 Para revisiones sobre secuenciadores de ADN, véase X. Li et al., PLoS One, 2013, 8, p. e67744, DOI: 10.1371/journal.pone.0067744; E. Ban et al., Electrophoresis, 2012, 33, p. 2, DO!: 10.1002/elps.20 1100344; T. C. Glenn, Mol. Eco/. Resour., 2011 , 11, p. 759, DO!: 10.1111/j.l755-0998.2011.03024.x; H. Kambara, Chem. Rec., 2010, 10, p. 8, DO!: 10.1002/tcr.200900010. 14 C. A. Emrich, H. Tian, l. L. Medintz y R. A. Mathies, Anal. Chem., 2002, 74, p. 5076, DO!: 10.1021/ac020236g; Agilent Technologies, Santa Clara, CA. ven a la misma velocidad. La razón de que todas las bandas se desplacen a la misma velocidad es que el campo eléctrico se hace más reducido para las bandas más móviles y más intenso para las bandas más lentas, de tal forma que la corriente es la misma, como tiene que ser, en todas las zonas de la disolución amorti– guadora. La corriente iónica que se origina como consecuencia del flujo de iones en la disolución amortiguadora es análoga a la corriente directa en un circuito formado por varios resistores conectados en serie a una batería. En este caso, la corriente debe ser idéntica en todos los resistores. Por tanto, el potencial en cada uno de ellos debe variar para que se cumpla la ley de Ohm. Cuando se alcanza el equilibrio en un experimento de iso– tacoforesis, cada uno de los componentes de la muestra migra en una banda que está intercalada entre la que contiene los iones que se mueven más lentamente y la banda siguiente cuyos iones se mueven con mayor rapidez, tal como se muestra en la figura 30.9b. La frontera entre las bandas es nítida. Si una especie del soluto empieza a desplazarse a la banda próxima más rápida, se encuentra con un campo más bajo, lo cual reduce su velocidad hasta hacerle retroceder a su banda original. Observe en la figura 30.8b que, a diferencia de lo que sucede en la electroforesis de zona o en lacro– matografía de elución, las bandas del analito son adyacentes entre sí y no están separadas por bandas de disolución amortiguadora. 30C.4 Enfoque isoeléctrico capilar Esta técnica se aplica para separar especies anfóteras, como ami– noácidos y proteínas que contienen en su estructura un grupo del ácido carboxílico que es débil y un grupo amino que es una base también débil. Propiedades de los compuestos anfóteros Un compuesto anfótero es una especie que en disolución es capaz tanto de ceder como de aceptar un protón. Un aminoácido repre– sentativo, como la glicina, es un compuesto anfótero. Cuando la glicina se disuelve en agua se originan tres equilibrios importantes: NH 2CH 2COOH ~ NH 3+CH 2COO– NH / CH2COO- + H20~NH 2 CH 2 COO- + H 30 + = [H30 +][NH2CH2COO- ] = 2 X 10 _ 10 ( 30 _ 8 ) K. [NH/ CH 2COO- ] NH / CH 2COO- + H 20 ~ NH/CH 2COOH + OH- [OH- ][NH3+CH2COOH] _ 12 J(, = = 2 X 10 (30 9) b [NH 3+CH 2Coo-] · La primera reacción corresponde a una reacción interna áci – do-base, y es semejante a la reacción que se observaría entre un ácido carboxílico sencillo y una amina sencilla. Una amina ali– fática característica tiene una constante de disociación básica de 10- 4 a 10- 5 y muchos ácidos carboxílicos tienen constantes de disociación ácidas del mismo orden de magnitud. El resultado es que la primera reacción se desplaza bastante hacia la derecha y el producto o productos de la misma predominan en la disolución. El aminoácido resultante de la primera reacción presenta carga tanto positiva como negativa, por lo que se denomina ion dipolar o zwitterión. Como lo muestran las constantes de equili– brio de las reacciones segunda y tercera (ecuaciones 30.8 y 30.9),