Principios de análisis instrumental

)}) 30( Aplicaciones de la electroforesis capilar 785 0.06 0.05 0.04 "' ·¡:¡ e "' ~ ~ 0.03 o e¡: "' "O B -;;; lC 0.02 "' C/) 0.01 A 0.00 -0.01 o 2 4 6 8 10 12 14 16 Tiempo, min FIGURA 30.12 Obtención de patrones electroforéticos de proteínas por electroforesis capilar de zona. Los electro– ferogramas presentan muestras de Staphylococcus (S. aureus) incubadas en dos medios de cultivo distintos (A y B). Los picos de electroforesis capilar se agruparon en tres regiones bien identificadas. Los tiempos de migración se utilizaron para identificar el medio de cultivo y diferenciar entre 5. aureus y 5. epidermidis. Capilar: sílice fundido sin cobertura de 50 ¡Jm. Detección: fluorescencia inducida por láser. Amortiguador: amortiguador de fosfatos pH 7. (Adaptada de M. T. Valedo, C. Pelaez-Lorenzo, R. Gonzalez, M. de Frutos, J. C. Diez-Masa, Anal. Chim. Acta, 2010, 658, p. 81, DOI: 10.1016/ j.aca.2009.10.053 .) troforesis zonal, el principal objetivo del medio polimérico era redu– cir la dispersión del analito causada por la difusión y la convección, así como proporcionar un medio adecuado para lograr la detección y el barrido. Este tipo de medio proporcionaba una acción de tamiz molecular que retrasaba la migración de las especies por analizar en diferentes grados, en función del tamaño de poro del polímero y del tamaño de los iones del analito. Dicho efecto de,tamiz es en especial útil en las separaciones de macromoléculas, como proteí– nas, fragmentos de DNA y oligonucleótidos que tienen en esencia la misma carga, pero distinto tamaño. En la actualidad la mayor parte de las separaciones a macroescala se llevan a cabo mediante la téc– nica ordinaria en gel, pero algunas separaciones por electroforesis de especies de diferente tamaño también se llevan a cabo en tubos capilares rellenos con gel. Tipos de geles El tipo de gel que más se utiliza en electroforesis es un polímero de poliacrilamida, formado por polimerización de la acrilamida (CH 2 = CH-CO-NH 2 ) en presencia de un agente de entrecru– zamiento. El tamaño de poro del polímero depende de la relación entre monómero y agente de entrecruzamiento, de tal manera que al incrementar la cantidad de este último hay una disminución del tamaño de poro. Otros geles que se han empleado en electro– foresis capilar en gel son la agarosa, un polisacárido extraído de un alga marina, la metilcelulosa, varios derivados de la celulosa, alcohol polivinílico, óxido de polietileno, dextrano, polidimetila- crilamida y polietilenglicol. Debido a la dificultad para llenar los capilares con geles rígidos, a menudo se recurre a las redes intrin– cadas de geles de polímeros. Esta estrategia permite llenar y vaciar el capilar con facilidad. Electroforesis capilar para obtener la secuenciación de DNA Uno de los principales objetivos del Proyecto del Genoma Humano fue determinar el orden en que aparecían las cuatro bases, adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), en las moléculas de ADN. El orden define el código genético de un individuo. La necesi– dad de conocer el orden del ADN produjo abundantes instrumentos analíticos nuevos. Entre los más atractivos está la electroforesis con arreglos de capilares. 11 En esta técnica se utilizan 96 capilares conec– tados en paralelo que se llenan con una matriz de separación, casi siempre un gel lineal de poliacrilamida. Los capilares poseen un diá– metro interior de 35 a 75 ¡.un y miden de 30 a 60 cm de longitud. Para conseguir el orden de las bases se extrae ADN de las células y se fragmenta mediante varios procedimientos. De acuerdo con la base terminal en el fragmento , se aplica una de cuatro tinciones fluorescente s a los diversos fragmentos. La muestra contiene muchos fragmentos de distintos tamaños, cada uno con su etiqueta fluorescente. Bajo la influencia de un campo 11 Para una revisión véase l. Kheterpal y R. A. Mathies, Anal. Chem., 1999, 71, p. 31A, DOI: 10.1021/ac990099w.