Principios de análisis instrumental

Estos reactivos reaccionan con oxígeno, peróxido de hidrógeno y muchos otros agentes oxidantes fuertes para originar un pro– ducto de oxidación quimioluminiscente. Elluminol es el ejemplo más común de este tipo de compuestos. Su reacción con oxidantes fuertes como oxígeno, peróxido de hidrógeno, el ion hipoclorito y el ion permanganato, en presencia de una base fuerte es A veces se necesita un catalizador para que la reacción transcurra a la velocidad adecuada. La emisión producida coincide con el espectro de fluorescencia del producto, el anión 3-aminoftalato. La quimioluminiscencia es azul y está centrada alrededor de 425 nm. Dentro de ciertos límites, la intensidad de quimioluminis– cencia del luminol es proporcional a la concentración del oxi– dante, del catalizador o delluminol. Por consiguiente, la reacción proporciona un método sensible para determinar cualquiera de estas especies. En otro ejemplo, utilizando peróxido de hidrógeno como oxidante, el catalizador CoH puede estimarse a concentra– ciones tan bajas como 0.01 nmol/L, Cr3+ hasta 0.5 nmol/L y el Cu 2 + hasta 1 nmol/L. Con algunos cationes se inhibe la luminis– cencia. En esos casos, el descenso en la intensidad facilita deter– minar las concentraciones. Determinaciones de especies orgánicas Para aumentar la selectividad de las reacciones quimioluminis– centes y ampliar la quimioluminiscencia a analitos que no partici– pan directamente en las reacciones de este tipo. es común efectuar paso a paso una reacción enzimática, en la cual el analito por determinar es el sustrato, y uno de los productos de la reacción enzimática se detecta mediante quimioluminiscencia. Lo más }} PREGUNTAS YPROBLEMAS ))) 150 Preguntas y problemas 375 común es ejecutarlo en sistemas de flujo con reactores que contie– nen la enzima inmovilizada. Sin embargo, la atención se ha diri– gido recientemente hacia los diseños con biosensores que utilizan enzimas unidas a fibras ópticas. En la etapa de predetección se utilizan de ordinario enzimas oxidasas que generan H 2 0 2 • No sólo puede determinarse el H 2 0 2 con distintos sistemas quimioluminiscentes, sino que el oxidante necesario (0 2 ) está presente ya en la mayoría de las muestras. Si se supone una conversión cuantitativa por efecto de la enzima, se pueden determinar los sustratos que están por abajo de 10 a 100 nM, lo mismo que el H 2 0 2 • Dentro de los sustratos detec– tados de esta forma están glucosa, colesterol, colina, ácido úrico, aminoácidos, aldehídos y lactato. Por ejemplo: , d , O uricasa l , O aci o urico + 2 ------> a antoma + H 2 2 El mismo enfoque se puede generalizar utilizando etapas enzimáticas sucesivas para convertir finalmente el analito en una cantidad equivalente de reactante quimioluminiscente. De esta manera, se determinaron azúcares distintos de la glucosa, glucósi– dos, ésteres del colesterol, creatinina y acetilcolina. 22 Por ejemplo, invertasa sacarosa+ H 2 0 a-n-glucosa + fructosa mutarotasa a-n-glucosa :;::::====~ {3-n-glucosa f3 l oxidasa de glucosa , "d l , . -n-g ucosa + 0 2 aCl o g ucomco + H 2 0 2 El luminol más una peroxidasa como catalizador parece ser un medio de reacción excelente para determinar H 2 0 2 • El máximo de intensidad quimioluminiscente se alcanza en casi 100 ms. El disolvente es agua y es compatible con algunos compues– tos orgánicos. El límite de detección es de alrededor de 0.1 pM, con linealidad para tres a cuatro decenas de concentración. "C. A. K. Swindlehurst y T. A. Nieman, Anal. Chim. Acta, 1988, 205, p. 195, DO!: 10.1 o 16/50003-2670(00)82328-4. *Las respuestas a los problemas marcados con un asterisco se proporcionan al final del libro. I EI Los problemas con este icono se resuelven mejor con hojas de cálculo. 15.1 Explique la diferencia que existe entre un espectro de emisión fluorescente y un espectro de excitación fluorescente . ¿Cuál de ellos se parece más a un espectro de absorción? 15.2 Defina los términos siguientes: a) fluorescencia, b) fosforescencia, e) fluorescencia de resonancia, d) estado sencillo, e) estado triplete,j) relajación vibracional, g) conversión interna, h) conversión externa, i) cruce entre sistemas,)) predisociación, k) disociación,/) eficiencia cuántica y m) quimioluminiscencia. 15.3 ¿Por qué la espectrofluorometría es potencialmente más sensible que la espectrofotometría? * 15.4 ¿Para cuál de los pares de compuestos siguientes se espera una mayor eficacia cuántica de fluorescencia? Explique.