Principios de análisis instrumental

782 Capítulo 30 Electroforesis capilar, electrocromatografía capilar y fraccionamiento por flujo y campo <« G1 i-Arg-Pro-C is-Asn-GIn-Ile-Tir-Cis MH+ M 2 H/+ 1~ l - 200 400 600 800 1000 1200 miz FIGURA 30.7 Espectro de masas de la vasotocina obtenido mediante ionización por electronebuliza ción. (Tomada de R. D. Smith, J. A. Olivares, N. T. Nguyen y H. R. Udseth, Anal. Chem., 1988, 60, p. 436. Con autorización.) 30C APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR Las separaciones por electroforesis capilar se llevan a cabo de dis– tintas maneras. 10 Entre ellas están la electroforesis capilar de zona, la electroforesis capilar en gel, el enfoque isoeléctrico capilar, la isotacoforesis capilar y la cromatografía micelar electrocinética. En las próximas secciones se ilustran las aplicaciones más relevan– tes de estas técnicas. 30C.1 Electroforesis capilar de zona En la electroforesis capilar de zona (CZE, por sus siglas en inglés), la composición de la disolución amortiguadora es constante en toda la zona de separación. El campo aplicado hace que los dife– rentes componentes iónicos de la mezcla migren cada uno según su propia movilidad y se separen en zonas que pueden estar definidas por completo o parcialmente traslapadas. Entre las zonas resueltas del todo hay huecos ocupados por disolución amortiguadora, como se puede ver en la figura 30.8a. Esta situación es análoga a la que se presenta en la cromatografía de elución en columna, en la que se observan regiones de fase móvil entre las zonas que contienen los analitos separados. Separación de iones pequeños En la mayoría de las separaciones electroforéticas de iones peque– ños se observan tiempos de análisis breves cuando los iones del analito se mueven en el mismo sentido que el flujo electroosmó– tico. Por consiguiente, en las separaciones de cationes las paredes 10 Para revisiones, véase V. A. Galievsky, A. S. Stasheuski, S. N. Krylov, Anal. Chem., 2015,87, p. 157, DOI: 10.1021/ac504219r; M. Geiger, A. L. Hogerton y M. T. Bowser, Anal. Chem., 2012, 84, p. 577, DOI: 10.1021/ac203205a; N. W. Frost, M. )ing y M. T. Bowser, Anal. Chem. , 2010, 82, p. 4682, DOI: 10.102l/acl0115lk. de los capilares no se tratan, y tanto el flujo electroosmótico como los cationes se desplazan hacia el cátodo. Por otro lado, en las separaciones de aniones, el flujo electroosmótico se suele invertir a causa del tratamiento de las paredes del capilar con una sal de alquilamonio, como el bromuro de cetil trimetilamonio. Los iones amonio con carga positiva se enlazan a la superficie de la sílice y forman una capa superficial inmóvil, de carga positiva. Esto, a su vez, crea una capa de disolución móvil, de carga negativa, que es atraída hacia el ánodo, lo que invierte el flujo electroosmótico. El método que más se utilizaba antes para el análisis de anio– nes pequeños era la cromatografía de intercambio iónico. Para los cationes, las técnicas favoritas fueron la espectroscopia de absor– ción atómica y la espectroscopia de emisión de plasma acoplado por inducción. En la figura 30.9 se ilustra la velocidad y la resolu– ción de las separaciones electroforéticas de aniones pequeños. En este caso, se separaron con limpieza 30 aniones en poco más de 3 minutos. Por lo regular, una separación de intercambio iónico de solo tres o cuatro aniones se puede lograr en este breve periodo. En la figura 30.10 también se ilustra la velocidad a la cual se pue– den efectuar las separaciones. En este ejemplo fueron separados 19 cationes en menos de 2 minutos. Alguna vez se pronosticó que los métodos de la electroforesis capilar reemplazarían los méto– dos establecidos tiempo atrás debido al bajo costo del equipo, las muestras de menor tamaño y el poco tiempo para el análisis. Sin embargo, a causa de que las variaciones en los flujos electrosmó– ticos dificultan la reproductibilidad de las separaciones con elec– troforesis capilar, todavía se usan ampliamente los métodos de cromatografía de líquidos y de espectrometría atómica para los iones inorgánicos pequeños. Separación de especies moleculares Mediante electroforesis capilar de zona es posible separar yana– lizar una gran variedad de moléculas pequeñas, como herbicidas sintéticos, plaguicidas y fármacos, siempre que sean iones o que puedan producirlos. En la figura 30.11 se ilustra este tipo de apli– cación del método, en el cual se separan en menos de 15 minutos tres fármacos antiinflamatorios con grupos carboxilo ionizables. También proteínas, aminoácidos y carbohidratos se han separado en tiempos mínimos mediante electroforesis capilar de zona. En el caso de los carbohidratos neutros, las separaciones están precedidas por la formación de complejos de borato con carga negativa. La electroforesis capilar se ha vuelto una técnica muy importante en el campo de la proteómica. Los análisis de proteínas en la orina están siendo utilizados para diagnosticar enfermedad renal crónica y patologías de la arteria coronaria. La obtención de patrones electroforéticos de varias proteínas mediante CZE también está cobrando importancia. En la figura 30.1 2. se muestra un ejemplo de CZE con fluorescencia indu– cida por láser para la detección e identificación de especies de Staphylococcus. La electroforesis capilar en gel también se utiliza ampliamente para secuenciar DNA como se explica en la sección siguiente. 30C.2 Electroforesis capilar en gel En general, esta técnica se lleva a cabo en una matriz polimérica con estructura de gel poroso que contiene una mezcla de disolución amortiguadora que llena los poros. En los primeros estudios en elec-