Principios de análisis instrumental

780 Capítulo 30 Electroforesis capilar, electrocromatografía capilar y fraccionamiento por flujo y campo «< Calce con orificio de 300 ¡l111 '~ Fuente o~ a) Capilar de / 75 ¡ll11 Detector Di scos / V d e plástico O Detector Capilar 1 c._,_> ~C Bu+ Ij a j.--~o ¡ O Fuente b) Fuente Revestimiento de plata q 1 ----~/' / '7' 7' 7\ --C) Detector e) FIGURA 30.4 Tres tipos de celdas para mejorar la sensibilidad de las mediciones de absorción en electroforesis capilar: a) celda tipo Z de 3 mm, b) celda tipo burbuja de 150 ¡Jm y e) celda de reflexiones múltiples. La figura 30.4b muestra una segunda estrategia para aumen– tar la longitud de trayectoria. En este ejemplo se forma una bur– buja cerca del extremo del capilar. En la versión comercial de esta técnica, la burbuja correspondiente a un capilar de 50 11m tiene un diámetro interno de 150 11m, el cual provoca un incremento de tres veces en la longitud de la trayectoria. Un tercer método para incrementar la longitud de trayecto– ria de la radiación por reflexión se muestra en la figura 30.4c. En esta técnica se deposita un revestimiento de plata reflectante en el extremo del capilar. La fuente de radiación experimenta entonces numerosas reflexiones durante el camino por el capilar, lo cual aumenta de manera notable la longitud de la trayectoria. Hay sistemas comerciales de electroforesis capilar con detec– tores con diodos en serie que permiten recolectar espectros en un intervalo de UV-visible en menos de 1 s. Detección indirecta. Se ha utilizado el método de detección indirecta de absorción en el caso de especies con baja absorti– vidad molar que resultan difíciles de detectar sin derivación. Se incorpora un cromóforo iónico en la disolución amortiguadora de la electroforesis; entonces, el detector recibe una señal cons– tante debido a la presencia de esta sustancia. El analito desplaza algunos de estos iones, como en la cromatografía de intercambio iónico, de manera que la señal detectada disminuye cuando una banda del analito pasa por el detector. El analito se determina por el descenso en el valor de la absorbancia. El electroferograma de la figura 30.5 se obt~vo con el método de detección indirecta de absorbancia, con ion cromato 4 mM como cromóforo; este ion absorbe radiación con fuerza a 254 nm en la disolución amorti– guadora. Aunque los picos obtenidos son negativos (descenso de A), se ven como positivos en la figura 30.6 porque se invierte la polaridad del detector. Detección por fluorescencia. Al igual que en la cromatogra– fía de líquidos de alta resolución, la detección por fluorescen– cia incrementa la sensibilidad y la selectividad para los analitos fluorescentes o los productos derivados de ellos. Se prefieren los instrumentos que emplean rayo láser para enfocar la radia – ción excitadora en el capilar y lograr los bajos límites de detección inherentes al empleo de fuentes intensas. Hay accesorios disponi– bles para la fluorescencia inducida por láser que se pueden aco– plar con los instrumentos comerciales para electroforesis capilar. La fluorescencia inducida por rayo láser facilita la detección de tan solo 10 zeptomoles o 6000 moléculas. 7 Detección electroquímica. En la electroforesis capilar se uti– lizan dos tipos de detección electroquímica: conductimétrica y amperométrica. Uno de los problemas con la detección electro– química ha sido aislar los electrodos del detector de la influencia del alto voltaje necesario para la separación. Uno de los métodos de aislamiento consiste en insertar una junta de vidrio poroso o grafito entre el extremo del capilar y un segundo capilar que con– tiene los electrodos del detector. Detección por espectrometría de masas. Los flujos volu– métricos en electroforesis capilar son tan pequeños, de menos de 1 11Limin, que hacen posible el acoplamiento directo del efluente a la fuente de ionización de un espectrómetro de masas. En la actua– lidad, la interfase que más se emplea para el proceso de introduc– ción de la muestra-ionización es el sistema de electronebulización (sección 20B.4), aunque también se ha empleado el bombardeo por átomos rápidos, la espectrometría de desorción (MALDI) y la 7 S. Wu y N. Dovichi, ]. Chromatogr., 1989, 480, p. 14 1, DO!: 10.1016/ 5002 1-9673(01 )84284-9.