Principios de análisis instrumental

Introducción de la muestra Los métodos más corrientes de introducción de las muestras son la inyección electrocinética y la inyección por presión. En el pri– mero se retiran del depósito de la disolución amortiguadora uno de los extremos del capilar y el correspondiente electrodo y se colocan en un pequeño recipiente donde está situada la muestra. Se aplica entonces un voltaje durante un tiempo determinado, lo que hace que la muestra penetre en el capilar debido a la com– binación de migración iónica y flujo electroosmótico. Luego, el extremo del capilar y el electrodo vuelven a introducirse en la disolución amortiguadora, donde se mantienen mientras dura el proceso de separación. Esta técnica de inyección tiene la caracte– rística de que introduce mayor cantidad de los iones más móviles y menos de los más lentos. En el método de inyección por presión, el extremo del capilar por donde se introduce la muestra se coloca de manera momentánea en un pequeño recipiente que la contiene y se utiliza una diferencia de presión para conducirla al interior del capilar. Esta diferencia de presión se origina al aplicar vacío en el extremo del detector, al aplicar presión en el recipiente que contiene la muestra o bien, elevando el extremo que contiene la muestra (inyección hidrodinámica). La inyección por presión no diferen– cia los iones de acuerdo con su movilidad y no puede utilizarse en capilares rellenos de gel. Tanto en el caso de la inyección electrocinética como en el de la inyección por presión, el volumen se controla mediante la duración de la inyección. Los volúmenes de inyección más usua– les están comprendidos entre 5 y 50 nL, pero se han llegado a emplear volúmenes por debajo de 100 pL. Para una disolución amortiguadora de densidad y viscosidad similares a las del agua, una diferencia de altura de 5 cm durante 10 s inyecta aproxima– damente 6 nL en un capilar cuyo diámetro interno es de 75 flm. El empleo de puntas de microinyección construidas a partir de capilares estirados hasta tener diámetros muy pequeños per– mite tomar muestras en el orden de los picolitros, como sucede con las células aisladas y estructuras en el interior de las mismas. Esta técnica se aplica para estudiar aminoácidos y neurotrans– misores procedentes de una sola célula. En las publicaciones especializadas se describen otras nuevas técnicas. 5 Ya se dispone de sistemas de electroforesis capilar en el comercio con carruse– les con temperatura controlada que adquieren diversas posiciones con el fin de lograr un muestreo automático. Detección Debido a que en la mayoría de las modalidades de electroforesis capilar los analitos separados se desplazan pasando por un punto común, los detectores son semejantes en cuanto a diseño y fun– ción a los de la cromatografía de líquidos de alta resolución que ya se describieron. En la tabla 30.1 se proporciona una lista de varios métodos de detección que se han dado a conocer para electrofore– sis capilar. En la segunda columna se dan los límites de detección característicos de estos instrumentos. 5 Para ejemplos, véase C.-C. Chen et al., Anal. Chem., 2007, 79, p. 195, DO!: 10.1021/ac061377b; S. l. Cho et al., f. Chromatogr. A, 2005, 1063, p. 253, DO!: 10.1016/j.chroma.2004.11.088; L. M. Ponton y C. E. Evans, Anal. Chem, 2001, 73, p. 1974, DO!; 10.102l/ac001145r. )}} 30B Electroforesis capilar 779 TABLA 30.1 Detectores para electroforesis capilar - . Límite de detección representativo*' Tipo de detector (attomoles detectados) Para espectrometría Absorciónt Fluorescencia Lentes térmicost Ramant Quimioluminiscenciat Espectrometría de masas Para electroquímica Conductividadt Potenciometríat Amperometría 1-1000 1-0.01 10 1000 1-0.0001 1-0.01 100 1 0.1 Fuentes: B. Huang, J.J. Li, L. Zhang, J. K. Cheng, Anal. Chem. , 1996,68, p. 2366, DO!: lO.l021/ac9511253; S. C. Beale, Anal. Chem., 1998, 70, p. 279R, DO!: 10.1021/ al9800141; S. N. Krylov y N. J. Dovichi, Anal. Che m., 2000, 72, p. lllR, DO!: 10.1021/a l000014c; S. Hu y N. /. Dovichi, Anal. Chem., 2002, 74, p. 2833, DO!: l0.1021/ac0202379. "Los límites de detección sei'lalados se determinaron con volúmenes de inyección que variaron de 18 pL a 10 nL. 1 Límite de detección de masa obtenido a partir del límite de detección de concen– tración con un volumen de inyección de 1 nL. Métodos de absorción. Los detectores de fluorescencia y absor– ción se usan ampliamente en electroforesis capilar, aunque los últimos son más comunes debido a que su campo de aplicación es mayor. Para que el volumen de detección se mantenga dentro del orden de magnitud de los nanolitros o menos, la detección se lleva a cabo en la columna. Para ello se elimina el revestimiento protector de poliimida de la parte externa de una pequeña sección del capilar mediante combustión o ataque de ácido. Este tramo del capilar hace las veces de celda de detección. Por desgracia, la lon– gitud de la trayectoria para tales mediciones no es mayor que 50 a 100 flm, lo cual restringe los límites de detección en términos de la concentración; sin embargo, debido a los pequeños volúmenes que se usan, los límites de detección de masa son iguales o mejo– res que los obtenidos en HPLC. Se han propuesto varios diseños de celdas con vistas a incre– mentar la longitud de la trayectoria de medición para mejorar la sensibilidad de los métodos de absorción. Tres de éstos se mues– tran en la figura 30.4. En el detector comercial que se ilustra en la figura 30.4a, el extremo del capilar está doblado en forma de Z, lo que origina una longitud de trayectoria hasta de 10 veces el diámetro del capilar. Los aumentos en la longitud de la trayec– toria ocasionan disminuciones en la eficacia del pico y, por con– siguiente, en la resolución. En algunos casos, lentes especiales, como las de globo esféricas, se insertan entre la fuente y la celda Z, y entre la celda y el detector. 6 Estas lentes mejoran la sensibilidad al enfocar la luz en la celda y eri. el detector. 6 D. M. Spence, A. M. Sekelsky y S. R. Crouch, Instrum. Sci. Technol., 1996, 24, p. 103, DO!: 10.1080/10739149608000472.