Principios de análisis instrumental

aplicado V e inversamente proporcional a la longitud L sobre la que se aplica. Entonces V V= JLe XL (30.2) Esta relación indica que es deseable aplicar voltajes elevados para obtener migraciones iónicas y separaciones rápidas. Si bien es deseable que las separaciones sean rápidas, es aún más importante que sean de alta resolución. Por ello es necesario examinar los fac– tores que determinan la resolución en la electroforesis. 308.2 Alturas de plato en electroforesis capilar En cromatografía, tanto la difusión longitudinal como la resisten– cia a la transferencia de masa contribuyen al ensanchamiento de banda. Sin embargo, dado que en la electroforesis solo hay una fase, en teoría solo se tiene que considerar la difusión longitudi– nal. Pero en la práctica, el calentamiento de Joule y el proceso de inyección pueden sumar discrepancias. La electroforesis zonal no es un proceso cromatográfico, pero las separaciones se describen a menudo de manera similar a la cromatografía. Por ejemplo, en la electroforesis se calcula la cantidad de platos N mediante ¡.;.,.V N= - 2D (30.3) donde D es el coeficiente de difusión del soluto, en cm 2 s - 1 • Debido a que la resolución se incrementa al aumentar el número de platos, se recomienda aplicar voltajes elevados con la finalidad de obtener separaciones con una gran resolución. Note que, para la electroforesis, al contrario de lo que sucede en cromatografía, el número de platos no se incrementa con la longitud de la columna. En la electroforesis zonal en gel, el calentamiento por el efecto Joule limita la magnitud del voltaje aplicado a un valor de alrede– dor de 500 V Es aquí donde radica una de las ventajas del formato capilar en comparación con el formato ordinario. La gran longi– tud y la pequeña área de la sección transversal del capilar hacen que la resistencia de la disolución en su interior sea excepcional– mente elevada. Como la disipación de energía es inversamente proporcional a la resistencia (P = ! 2 / R), se pueden aplicar volta– jes muchísimo más altos a los capilares que a las placas para una misma cantidad de calor. Además, la alta relación superficie-vo– lumen del capilar proporciona un enfriamiento efectivo. Como resultado de estos dos factores, el ensanchamiento de banda, debido a la convección térmica, no tiene lugar a un grado impor– tante en los capilares. Por lo regular se usan campos eléctricos de 100 a 400 V/cm. Las fuentes de potencia de alto voltaje de 10 a 25 kV son normales. Los campos elevados causan mejoras corres– pondientes en la velocidad y en la resolución por arriba de las que se obtienen con el formato de placa. A menudo, el ancho de los a) >» 30B Electroforesis capilar 777 picos en la electroforesis capilar alcanza el límite teórico marcado por la difusión longitudinal. Por lo regular, la electroforesis capi– lar genera una cantidad de platos comprendido entre 100 000 y 200 000, en comparación con los típicos 5000 a 20 000 platos de la cromatografía de líquidos de alta resolución. También se han dado a conocer cantidades de platos de 3 000 000 en el caso de separaciones mediante electroforesis capilar de zona de aminoá– cidos dansilados 2 y de 1 O 000 000 para las separaciones de polinu– cleótidos por electroforesis capilar en gel. 3 308.3 Flujo electroosmótico Una característica única de la electroforesis capilar es el flujo elec– troosmótico. Cuando se aplica un alto voltaje a un capilar de sílice fundida que contiene una disolución amortiguadora, se origina por lo regular un flujo electroosmótico en el cual el líquido migra hacia el cátodo. La velocidad de migración puede ser apreciable. Por ejemplo, una disolución amortiguadora 50 mM de pH 8 migra hacia el cátodo por un capilar de 50 cm a una velocidad de aproxi– madamente S cm/min cuando se aplica un voltaje de 25 kV. 4 Se sabe que, la causa del flujo electroosmótico es la doble capa eléctrica que se forma en la interfase sílice-disolución. A valores de pH por encima de 3, la pared interna de un capilar de sílice presenta carga negativa debido a la ionización de los grupos silanol (Si-OH) en su superficie. Los cationes de la disolución amortiguadora se agrupan sobre la doble capa eléctrica adyacente a la superficie negativa del capilar de sílice. Los cationes situados en la capa exterior difusa de la doble capa son atraídos hacia el cátodo o electrodo negativo, y dado que los cationes están solvata– dos arrastran al disolvente con ellos. Como se ilustra en la figura 30.2a, la electroósmosis ocasiona un flujo de la disolución que tiene un perfil plano en el tubo porque se origina en las paredes del mismo. Este perfil contrasta con el perfil laminar (parabólico) que se observa en el flujo generado por la presión que se encuen– tra en la cromatografía de líquidos de alta resolución (figura 30.2b). Puesto que el perfil es en esencia plano, el flujo electroos– mótico no contribuye de manera importante al ensanchamiento de banda en la forma en que el flujo generado por presión lo hace en la cromatografía de líquidos. Generalmente, la velocidad del flujo electroosmótico es mayor que la velocidad de migración electroforética de los iones individuales y llega a ser, en la práctica, el mecanismo de bombeo de la fase móvil en la electroforesis capilar. Aun cuando los ana– litas migran según sus cargas dentro del capilar, la velocidad del 2 R. D. Smith, ). A. Olivares, N. T. Nguyen y H. R. Udseth, Anal. Chem., 1988, 60, p. 436, DO!: 10.1021 /ac00 156a01 3. 3 A. Guttman, A. S. Cohen, D. N. Heiger y B. L. Karger, Anal. Chem., 1990, 62, p. 137, DO!: 10.1021 /ac00201a010. 4 ). D. Olechno, ). M. Y. Tso, ). Thayer y A. Wainright, Amer. Lab., 1990,22 (17), p. 51. b) FIGURA 30.2 Perfiles de flujo para líquidos bajo a) flujo electroosmótico y b) flujo inducido por presión.