Principios de análisis instrumental

776 Capítulo 30 Electroforesis capilar, electrocromatografía capilar y fraccionamiento por flujo y campo <« Contenedor de seguridad Detector Capilar de regulador FIGURA 30.1 Esquema de un sistema de electroforesis capilar. impulsa los iones de la muestra a migrar hacia uno u otro de los electrodos. La velocidad de migración de una especie depende de su carga y de su tamaño. Por consiguiente, las separaciones se basan en las diferencias de la relación carga-tamaño entre los diferentes analitos presentes en la muestra. Cuanto mayor es esta relación, más rápido migra un ion en el campo eléctrico. 30A.1 Tipos de electroforesis En la actualidad, las separaciones electroforéticas se llevan a cabo en dos modalidades distintas: electroforesis zonal y electroforesis capilar. La primera es la metodología clásica que se ha utilizado durante muchos años para separar especies complejas, de elevada masa molecular, de interés biológico y bioquímico. Las separa– ciones ordinarias se efectúan sobre una capa delgada y plana o sobre una placa hecha de un gel semisólido y poroso que contiene una disolución amortiguadora acuosa en el interior de sus poros. Esta placa tiene dimensiones de unos pocos centímetros de lado y, al igual que las placas de cromatografía en capa fina, es capaz de separar varias muestras en forma simultánea. Dichas muestras se introducen en la forma de manchas o bandas sobre la placa y se aplica un campo eléctrico de corriente continua a la placa durante un periodo fijo. Al completarse las separaciones, se interrumpe el paso de la corriente y las especies separadas se tiñen para poder verlas de modo similar a como se describió para la cromatografía en capa fina en la sección 28I.2. Por ahora, la electroforesis zonal es la técnica de separación más ampliamente utilizada en biología y bioquímica. Un examen detenido de monografías, libros de texto o revistas de los cam– pos de las ciencias de la vida proporciona cientos de fotografías de desarrollos electroforéticos ordinarios. La electroforesis capilar, que es una versión con instrumentos de la electroforesis, surgió a mediados de los años ochenta y se convirtió en una herramienta importante para una gran diversidad de problemas de separación analítica. En muchos casos, esta nueva modalidad para efectuar separaciones electroforéticas es un sustituto satisfactorio de la electroforesis zonal, con diversas e importantes ventajas que se explican más adelante. 30A.2 Fundamentos de las separaciones electroforéticas La velocidad de migración de un ion, v, cm/s, dentro de un campo eléctrico, es igual al producto de la fuerza del campo eléctrico E (V cm - I) por la movilidad electroforética JLe(cm 2 y - I s- 1 ). Es decir, (30.1) A su vez, la movilidad electroforética es directamente propor– cional a la carga iónica del analito e inversamente proporcional a los factores de retardo por fricción. El campo eléctrico actúa únicamente sobre los iones. Si dos especies difieren en la carga o en las fuerzas de fricción, se desplazan por la disolución amorti– guadora y se separan entre sí. Las especies neutras no se separan. La fuerza de retardo por fricción en un analito cargado se deter– mina a partir del tamaño y de la forma del ion y de la viscosidad del medio en el cual migra. En el caso de iones del mismo tamaño, cuanto mayor es la carga, mayor es la fuerza impulsora y habrá una velocidad de migración más rápida. Para los iones que pre– senten la misma carga, cuanto menor sea el ion, más pequeña es la fuerza de fricción y la velocidad de migración será más rápida. La relación carga-tamaño de los iones combina estos dos efectos. Observe que, a diferencia de la cromatografía, en una separación electroforética solo se requiere una fase. 30B ELECTROFORESIS CAPILAR La electroforesis zonal es de gran utilidad, aunque también es lenta, laboriosa y difícil de automatizar. Además, no proporciona resulta– dos cuantitativos precisos. La investigación y la aplicación de la elec– troforesis llevada a cabo en tubos capilares tuvieron un crecimiento explosivo durante la segunda mitad de la década de los ochenta y surgieron varios instrumentos comerciales. La electroforesis capilar (EC), produce separaciones de alta velocidad y alta resolución con volúmenes de muestra extraordinariamente pequeños (de 0.1 a 10 nL, en contraste con la electroforesis zonal, que emplea volúme– nes de muestra del orden de [!L). Además, las especies separadas son eluidas desde uno de los extremos del capilar, por lo que se pueden utilizar detectores cuantitativos como los que se emplean en croma– tografía de líquidos de alta resolución, en lugar de las incómodas técnicas de coloración de la electroforesis zonal. 1 308.1 Velocidades de migración en electroforesis capilar Como ya se vio en la ecuación 30.1, la velocidad de migración de un ion v depende de la fuerza del campo eléctrico aplicado. A su vez, el campo eléctrico es proporcional a la magnitud del voltaje 1 Para mayor información acerca de la electroforesis zonal, consulte Capi/lary Electro– phoresis and Microchip Capillary Electrophoresis, C. D. Garcia, K. Y. Chumbimuni-Tor– res y E. Carrilho, eds., Hoboken, N]: Wiley, 2013; Analysis and Detection by Capillary Electrophoresis, M. L. Marina, A. Rios y M. Valcarcel, eds., vol. 45 of Comprehensive Analytical Chemistry, D. Barcelo, ed., Amsterdam: Elsevier, 2005; R. Weinberger, Prac– tica/ Capillary Electrophoresis, 2a. ed., New York: Academic Press, 2000; High Perfor– mance Capillary Electrophoresis, M. G. Khaledi, ed., New York: Wiley, 1998.