Principios de análisis instrumental

440 Capítulo 18 Espectroscopia Raman <« Resonancia Raman Fluorescencia a) b) FIGURA 18.11 Diagrama de energía para a) la difusión Raman de resonancia y b) la emisión fluorescente. La relajación no radiante se indica con flechas onduladas. En el caso de la resonancia Raman, el electrón excitado se relaja de inmediato a un nivel de vibración del estado electrónico fundamental al ceder un fotón Stokes v,. En la fluorescencia, la relajación hasta el nivel de vibración más bajo del estado electrónico excitado ocurre antes de la emisión. La difu– sión Raman de resonancia es casi instantánea, y las bandas espec– trales son muy angostas . En general, la emisión de fluorescencia tiene lugar en la escala de tiempo de nanosegundos. Los espectros de fluorescencia son casi siempre anchos debido a los diversos esta– dos vibracionales. estado electrónico fundamental. Como se muestra en la figura, la dispersión Raman de resonancia difiere de la fluorescencia (figura IS.llb) en que la relajación al estado fundamental no está pre– cedida de una relajación hacia el nivel vibracional más bajo del estado electrónico excitado. Las escalas de tiempo para los dos fenómenos son también bastante diferentes, la relajación Raman ocurre en menos de 10 - 14 s; en cambio, la emisión fluorescente tiene lugar entre 10- 6 a 10- 10 s. La intensidad de las líneas en un experimento Raman de resonancia aumenta con rapidez cuando la longitud de onda de excitación se aproxima a la longitud de onda de la banda de absor– ción electrónica. Por consiguiente, se necesita un láser sintoniza– ble para conseguir el mayor incremento de sefíal en un intervalo ancho de máximos de absorción. Con una radiación láser intensa, la descomposición de la muestra se puede convertir en un gran problema porque las bandas de absorción electrónica se producen con frecuencia en la región ultravioleta. Para evitar este problema, es una práctica normal desplazar la muestra de forma circular por delante del haz enfocado del láser. Para hacer circular la muestra hay dos maneras: bombear la disolución o el líquido a través de un capilar instalado en el compartimiento de la muestra o girar una celda cilíndrica que contiene la muestra a través del rayo láser. De esta manera, sólo una pequefía fracción de la muestra es irradiada en un instante dado, y así se reduce al mínimo su calentamiento y descomposición. Tal vez la aplicación más importante de la espectroscopia Raman de resonancia es el estudio de moléculas biológicas en condiciones fisiológicamente importantes; es decir, en presencia de agua y a concentraciones de bajas a moderadas. Por ejemplo, la técnica se utiliza para determinar el estado de oxidación y el espín de los átomos de hierro en la hemoglobina y el citocromo c. En estas moléculas, las bandas Raman de resonancia se deben úni– camente a los modos de vibración del cromóforo del tetrapirrol. Ninguna de las otras bandas asociadas con la proteína se acentúa y, por tanto, éstas no interfieren en las concentraciones que se uti– lizan normalmente. La espectrometría Raman de resonancia con resolución en el tiempo es una técnica que facilita la recolección de espectros Raman de moléculas en estado excitado. Se utiliza para estudiar los intermediarios en las reacciones enzimáticas, los espectros de los estados excitados de los carotenoides, las etapas ultrarrápidas de transferencia de electrones y una variedad de otros procesos bio– lógicos y bioinorgánicos. 12 Los métodos de discriminación en el tiempo se aplican para superar una de las principales limitaciones de la espectroscopia Raman de resonancia, a saber, la interferen– cia causada por la fluorescencia del propio analito o de otras espe– cies presentes en la muestra. 180.2 Espectroscopia Raman de superficie aumentada La espectroscopia Raman de superficie aumentada 13 supone la obtención de espectros Raman, a la manera usual, de muestras que se adsorben sobre la superficie de partículas metálicas coloi– dales, casi siempre plata, oro o cobre; o bien, sobre superficies rugosas de trozos de estos metales. Por razones que apenas se empiezan a entender, al menos semicuantitativamente, las líneas Raman de la molécula adsorbida se intensifican a menudo en un factor de 10 3 a 10 6 . Se cree que la mejora de la superficie surge de dos factores. Primero, hay una mejora debido al campo electromagnético. Esto ocurre porque la onda electromagnética incidente interactúa con la superficie del metal para excitar los plasmones superficia– les localizados, lo que amplifica el campo cerca de la superficie. Debido a que la dispersión de Raman se escala como la cuarta potencia del campo, este efecto puede mejorar las señales hasta en un factor de 10 000. El segundo factor es una mejora química que ocurre debido a que la molécula adsorbida interactúa con la superficie. Dicho efecto puede mejorar la sefíal de Raman hasta lOO veces. La mejora neta es el producto de los dos efec– tos, que pueden ser de aproximadamente de 1 millón. 14 Cuando el incremento de superficie se combina con la técnica de resonan– cia aumentada, que se trató en la sección anterior, el incremento neto de la intensidad de la señal es más o menos el producto de la intensidad producida por cada una de las técnicas. En consecuen– cia, se han llegado a conseguir límites de detección del orden de 10- 9 a 10- 12 M. 12 ). R. Kincaid·y K. Czarnecki en Comprehensive Coordination Chemistry /l, ). A. McCleverty y T. ). Meyer, eds., Oxford: Elsevier, 2004. 13 Véase M.). Weaver, S. Zou y H. Y. Chan, Anal. Chem. , 2000, 72, p. 38A, DO!: 10.1021/ac0027136. American Chemical Society. '·'véase P. L. Stiles, ). A. Dieringer, N. C. Shah y R. P. Van Duyne, Ann. Rev. Anal. Chem., 2008, 1, p. 601, DO!: 10.1146/annurev.anchem.l.031207.112814.