Principios de análisis instrumental

281 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Entre los métodos de cromatografía en plano están la cromatogra– fía en capa fina (TLC, por sus siglas en inglés) y la cromatografía en papel (CP). En todos los casos se emplea una capa plana y rela– tivamente delgada de un material que a la vez es el soporte, o bien, cubre una superficie de vidrio, plástico o metal. La fase móvil se desplaza por la fase estacionaria por acción capilar, a veces ayu– dada por la gravedad o por la aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad, la cromatografía en plano se centra en la técnica de capa fina, que es más rápida, tiene mejor resolución y es más sensible que la cromatografía en papel. Esta sección se dedica solo a los métodos de capa fina. 281.1 Campo de aplicación de La cromatografia en capa fina Desde un punto de vista teórico, los tipos de fases móviles y esta– cionarias, así como las aplicaciones de cromatografía en capa fina son muy similares a las de la cromatografía de líquidos. De hecho, las técnicas de la cromatografía en capa fina se aplican para desarrollar las condiciones para las separaciones en croma– tografía de líquidos de alta resolución. En algún momento, los métodos de cromatografía en capa fina se utilizaron ampliamente en la industria farmacéutica. En la actualidad, esas técnicas han sido reemplazadas por los métodos de la cromatografía de líqui– dos, los cuales se pueden automatizar con facilidad y son más rápidos. La cromatografía en capa fina tiene amplio uso en los laboratorios clínicos y es la estructura de apoyo de muchos estu– dios bioquímicos y biológicos. También tiene muchas aplicacio– nes en los laboratorios industriales.' 10 Debido a sus muchas áreas de aplicación es que sigue siendo una técnica importante. 281.2 Fundamentos de La cromatografia en capa fina Las separaciones en capa fina características se realizan en placas de vidrio revestidas con una capa delgada y adherente de partícu– las finamente divididas; esta capa constituye la fase estacionaria. Las partículas son semejantes a las de la cromatografía por adsorción, de reparto en fase normal y en fase inversa, de intercambio iónico y de exclusión por tamaño. Las fases móviles también son similares a las que se emplean en la cromatografía de líquidos de alta resolución. Preparación de las placas de capa fina Una placa de capa fina se prepara extendiendo una lechada acuosa del sólido finamente pulverizado sobre la superficie limpia de una lámina de vidrio o plástico o sobre el portaobjetos de un microscopio. A menudo se añade un aglutinante a la lechada para aumentar la adhesión de las partículas sólidas al vidrio y entre las mismas partículas. Luego se deja reposar la lámina hasta que haya 40 Entre los libros dedicados a los fundamentos y aplicaciones de la cromatografía en capa fina están Handbook ofThin-Layer Chromatography, 3a. ed., ). Sherma y B. Fried, eds., New York: Dekker, 2003; B. Fried y). Sherma, Tlún Laye.- Chromatogra– phy, 4a. ed., New York: Dekker, 1999. Para revisiones sobre cromatografía planar, véase J. Sherma, Anal. Chem., 2010,82,4895, DO!: 10.1021 /ac902643v; f. Anal. Chem., 2008, 80,4253, DO!: 10.1021/ac702341; Anal. Chem., 2006, 78, 3841, DO!: 10. 1021/ac0600981. ))) 28! Cromatografía en capa fina 757 secado y las partículas estén muy bien adheridas a la superficie; en algunos casos se calienta en un horno durante varias horas. Hay empresas de equipo para laboratorios químicos que ofrecen láminas precubiertas de varias clases. Los precios son de algunos dólares por lámina. Las dimensiones comunes en centímetros son 5 X 20, 10 X 20 y 20 X 20. Las placas comerciales se presentan en dos categorías: la ordina– ria y la de alto rendimiento. La capa de la primera es más gruesa (de 200 a 250 f.tm) con partículas cuyas dimensiones son de 20 f.lD1 o más. Las placas de alto rendimiento tienen por lo general películas de unos 100 f.lD1 de espesor y partículas de un diámetro de 5 f.lD1 o menos. Las placas de alto rendimiento proporcionan mejores separaciones y en menos tiempo. Pero tienen la desventaja de tener una capacidad sig– nificativamente menor de carga que las placas ordinarias. Aplicación de la muestra La aplicación de la muestra es tal vez el aspecto más decisivo de la cromatografía en capa fina, sobre todo cuando se trata de medidas cuantitativas. Por lo general se aplica una disolución de la muestra de 0.01 a 0.1% como un punto a 1 o 2 cm del extremo de la placa. Para una separación más eficaz, este punto o mancha debe tener un diámetro mínimo, alrededor de 5 mm para un trabajo cuali– tativo y menor para el análisis cuantitativo. En el caso de disolu– ciones diluidas, se realizan tres o cuatro aplicaciones superpuestas secando la zona entre aplicación y aplicación. La aplicación manual de las muestras se efectúa por contacto entre la placa y un capilar que contiene la muestra, o con una jeringa hipodérmica. Hay varios aplicadores mecánicos comerciales que mejoran la precisión y exactitud de la aplicación de la muestra. Desarrollo de la placa El desarrollo de la placa es un proceso en el cual una muestra es arrastrada a lo largo de la fase estacionaria por una fase móvil; es similar a la elución en la cromatografía de líquidos. La forma más común de crear una placa es depositar una gota de la muestra cerca de uno de los extremos de la placa y marcar su posición con un lápiz. Una vez que se ha evaporado el disolvente en el que estaba disuelta la muestra, se coloca la placa en un recipiente cerrado y saturado con los vapores del disolvente con el que se efectuará el proceso. Uno de los extremos de la placa se introduce en el disolvente de desarrollo, pero se procura evitar el contacto directo de éste con la muestra (figura 28.28). Una vez que el disolvente de desarrollo se desplazó la mitad o las dos terceras partes de la longitud de la placa, se retira ésta del recipiente y se seca. Las posiciones de los com– ponentes de la muestra se determinan entonces por cualquiera de varios procedimientos. Ubicación de los analitos en la placa Se pueden aplicar una diversidad de procedimientos para locali– zar los componentes de la muestra después de la separación. Dos de los métodos comunes, que se utilizan con la mayoría de las mezclas de sustancias orgánicas, consisten en rociar sobre la placa una disolución de ácido sulfúrico o colocar la lámina en una cámara que contiene algunos cristales de yodo. Ambos reacti– vos son sensibles a los compuestos orgánicos que están en la placa y dan productos oscuros. También se utilizan varios reactivos espe– cíficos como la ninhidrina para localizar las especies separadas.