Principios de análisis instrumental

756 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos de alta resolución <« 15 14 4 20 Tiempo de elución, min a) n=2 25 11=0 n = 2 1-+------- 4 min -------+1 b) FIGURA 28.27 Aplicaciones de la cromatografía de exclusión por tamaño. a) Separación de ácidos grasos. Columna: poliestireno, de 7.5 X 600 nm , con un límite de exclusión de 1 X 10 3 • Fase móvil: tetrahidrofurano. Velocidad de flujo: 1.2 ml/ min. Detector: índice de refracción. b) Análisis de una resina epóxica comercial (n = número de unidades monoméricas en el polímero) . Columna: de sílice porosa 6.2 x 250 mm. Fase móvil: tetrahidrofurano. Velocidad de flujo: 1.3 ml/ min . Detector: absorción UV. (Cortesía de BTR Separations.) con masas moleculares :M entre 116 y 344 mediante un relleno de poliestireno con un límite de exclusión por tamaño de 1000. El segundo es el cromatograma de una resina epóxica comercial tam– bién mediante un relleno de poliestireno. En este caso, n se refiere al número de unidades monoméricas (:M= 264) en las moléculas. Otra importante aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño es en la determinación rápida de las masas moleculares o en la distribución de masas moleculares en los grandes políme– ros o en los productos naturales. La clave de tales determinaciones es una calibración exacta de la masa molecular. La calibración se puede conseguir mediante patrones de roasa molecular conocida (véase la figura 28.26) o por medio del método de calibración uni– versal. Este último se basa en el principio de que el producto de la viscosidad molecular intrínseca 1J y la masa molecular :M es pro– porcional al volumen hidrodinámico (volumen efectivo incluida la cubierta de solvatación). Idealmente, las moléculas se separan con la cromatografía de exclusión por tamaño de acuerdo con el volu– men hidrodinámico. Por tanto, una curva de calibración universal se obtiene al graficar log (7J:M) contra el volumen de retención VR. De otra manera, la calibración absoluta se puede alcanzar usando un detector molar sensible a la masa como el detector de disper– sión de la luz en ángulo bajo. Entre las ventajas más importantes de los procedimientos de exclusión por tamaño están 1) tiempos de separación cortos y muy bien definidos (todos los solutos dejan la columna entre V 0 y V 0 + V¡ en la ecuación 28.9 y la figura 28.26); 2) bandas estre– chas, las cuales ocasionan buena sensibilidad; 3) no hay pérdida de muestra porque los solutos no interaccionan con la fase esta– cionaria, y 4) no se desactiva la columna por la interacción del soluto con el relleno. Las desventajas son 1) solo una cantidad limitada de bandas se pueden acomodar porque la escala de tiempo del cromato– grama es corta y 2) inaplicabilidad con muestras de dimensiones similares, como los isómeros. En general, se requiere una diferen– cia de 10% en las masas moleculares para conseguir una resolu– ción razonable. Algunas separaciones que se llevan a cabo de manera tradi– cional por cromatografía de exclusión por tamaño están siendo llevadas a cabo en la actualidad mediante fraccionamiento de flujo de campo como se discute en el capítulo 30. 28H CROMATOGRAFÍA POR AFINIDAD Para la cromatografía por afinidad se requiere el enlace covalente de un reactivo, llamado ligando por afinidad, con un soporte sólido. 39 Los ligandos por afinidad característicos son anticuerpos, inhibido– res de enzimas u otras moléculas que en forma reversible y selectiva se enlazan a las moléculas del analito en la muestra. Cuando esta última pasa por la columna, solo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad. Las moléculas que no se unen atraviesan la columna con la fase móvil. Después de que se eliminan las moléculas indeseables, los analitos retenidos pueden ser arrastrados cambiando las condiciones de la fase móvil. La fase estacionaria para la cromatografía por afinidad es un sólido como la agarosa o cuentas de vidrio poroso en las que el ligando por afinidad está inmovilizado. La fase móvil en la cro– matografía por afinidad desempeña dos papeles distintos. Primero, debe soportar el fuerte enlace de las moléculas del analito con el ligando. Segundo, una vez que se han eliminado las especies inde– seables, la fase móvil debe debilitar o eliminar la interacción anali– to-ligando de modo que el analito pueda ser eluido. Con frecuencia se aprovechan los cambios en el pH o la potencia iónica para modi– ficar las condiciones de elución durante las dos etapas del proceso. La principal ventaja de la cromatografía por afinidad es que es muy específica. Se utiliza de modo principal para aislar con rapidez biomoléculas durante el trabajo de preparación. 39 Para mayores detalles sobre la cromatografía de afinidad, véase M. Zachariou, ed., Affinity Chromatography: Methods and Protocols, 2a. ed., Totowa, N): Humana Press, 2007; D. S. Hage ed., Handbook ofAffinity Chromatography, 2a. ed., Boca Raton, FL: CRC Press, 2006.