Principios de análisis instrumental

754 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos de alta resolución «< copolímeros estireno-divinilbenceno enlazados en forma entre– cruzada semejantes en estructura (excepto que carecen de los gru– pos de ácido sulfónico) a los que se muestran en la figura 28.21. El tamaño del poro en estos polímeros se controla por el grado de entrecruzamiento entre las cadenas poliméricas y, por tanto, por la cantidad relativa de divinilbenceno presente durante su manu– factura. Entonces, se han comercializado los rellenos poliméricos con distintos tamaños promedio de poro. Originalmente los geles de estireno-divinilbenceno eran hidrófobos y, de este modo, solo podían utilizarse con fases móviles no acuosas. Pero en la actuali– dad se dispone de geles hidrófilos, que permiten usar disolventes acuosos para la separación de moléculas grandes y solubles en agua como los azúcares. Por lo general, estos geles hidrófilos son divi– nilbencenos sulfonados o poliacrilamidas. La cromatografía que se basa en los rellenos hidrófilos se llamaba antes filtración en gel y las técnicas basadas en los rellenos hidrófobos se denominaban penetración sobre gel. En la actualidad ambas técnicas están com– prendidas en los métodos de exclusión por tamaño. En ambos tipos de rellenos se dispone de muchos diámetros de poro. Por lo regular, un relleno aloja de 2 a 2.5 intervalos de década de masa molecular. La masa molecular promedio adecuado para un relleno en particu– lar puede ser desde unos pocos cientos hasta varios millones. En la tabla 28.4 se proporcionan las propiedades de algunos rellenos comerciales característicos de la exclusión por tamaño. 28G.2 Teoria de la cromatografia de exclusión por tamaño El volumen total V, de una columna rellena con gel de sílice o con un polímero poroso es (28.9) donde Vg es el volumen que ocupa la matriz sólida del polímero o del gel, V¡ es el volumen del disolvente retenido en sus poros y V 0 es el volumen libre exterior a las partículas. Si se supone que no hay mezcla ni difusión, V 0 también representa el volumen teó– rico de disolvente que se necesita para transportar a través de la columna los componentes que son demasiado grandes para entrar en los poros. Sin embargo, tiene lugar de hecho cierta difusión y mezcla, y como consecuencia de ello los componentes que no son retenidos aparecen en una banda de forma gaussiana con una concentración máxima en V 0 • En el caso de componentes muy pequeños que entran sin problema en los poros del polímero o del gel, los máximos de la banda aparecen al final de la columna con un volumen de eluyente que corresponde a (V¡+ V 0 ). Por lo gene– ral, V¡, V 0 y Vg son del mismo orden de magnitud y, por tanto, una columna de exclusión por tamaño permite separar las moléculas grandes de las pequeñas en una muestra con un volumen mínimo de eluyente. Las moléculas de tamaño intermedio tienen la capacidad de transferirse a una fracción K del disolvente que ocupa los poros; el volumen de elución Ve para estas moléculas retenidas es (28.1O) La ecuación 28.10 se aplica a todos los solutos presentes en la columna. Para lasmoléculas que son demasiado grandes para entrar en los poros, K = O y Ve = V 0 ; para las moléculas que pueden entrar en los poros libremente, K= 1 y Ve = (V 0 + V¡). Al deducir la ecuación 28.1 O, se plantea la hipótesis de que no existe interac– ción alguna, como la adsorción, entre las moléculas del soluto y la superficie del polímero o del gel. Si hubiera adsorción, aumentaría la cantidad de soluto retenido intersticialmente; con las moléculas pequeñas, K tendrá entonces un valor mayor que la unidad. La ecuación 28.1 O puede reordenarse como (28.11) donde K es la constante de distribución del soluto (véanse las ecuaciones 26.1 y 26.2). Los valores de K oscilan desde cero, para las moléculas grandes totalmente excluidas, hasta la unidad, en el caso de las moléculas pequeñas. La constante de distribución es un parámetro valioso para comparar la información de distintos rellenos. Además, hace posible la aplicación de todas las ecuacio– nes de la tabla 26.5 a la cromatografía de exclusión. El intervalo útil de masa molecular para un determinado relleno de exclusión por tamaño se ilustra de manera satisfactoria por medio de una curva de calibración como la que se muestra en la figura 28.26a. En este caso, la masa molecular, que está direc– tamente relacionada con el tamaño de las moléculas de soluto, se grafica frente al volumen de retención VR, que es el producto del tiempo de rétención por la tasa de flujo volumétrico. Observe que la escala en las ordenadas es logarítmica. El límite de exclusión TABLA 28-4 Propiedades de los rellenos comercia les característicos para la cromat ograña de exclusión por tamaño • • • •• > .- • • • <··. '' • • ·-_ tirri¡ño de. : ~. . Tamafio promedio Límite de exclusión . Tipo partícula, f.lm del poro, A . de masa molecular* · Poliestireno de divinilbenceno 10 100 700 1000 (0.1 a 20) X 10 4 10 4 (1 a 20) X 10 4 105 (1 a 20) X 10 5 106 (5 a > 10) X 10 6 Sílice 10 125 (0.2 a 5) X 10 4 300 (0.03 a 1) X 10 5 500 (0.05 a 5) X 10 5 1000 (5 a 20) X 10 5 *Masa molecular por encima de la cua l no se produce la retención.