Principios de análisis instrumental

740 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos de alta resolución <« a) Cromatografía de fase normal Fase móvil de baja polaridad --Tiempo- Fase móvil de polaridad media --Tiempo- b) Cromatografía de fase reversa Fase móvil de alta polaridad --Tiempo- Fase móvil de polaridad media --Tiempo- Polaridades del soluto: A> B > C FIGURA 28.14 Relación entre la polaridad y los tiempos de elución en cromatografía en fase normal y en fase inversa. gráficos con cola en especial con solutos básicos. Para reducir este efecto, los rellenos de siloxano muchas veces se desactivan por un proceso de bloqueo mediante reacción con clorotrimetilsilano, el cual, debido a su pequeño tamaño, puede unirse químicamente a muchos de los grupos silanol que no habían reaccionado. Rellenos de fase normal y de fase inversa Con base en las polaridades relativas de las fases móvil y estacio– naria, se distinguen dos tipos de cromatografía de partición. En un principio, la cromatografía de líquidos utilizaba fases estacionarias de elevada polaridad, como el agua o el trietilenglicol; como fase móvil se empleaba un disolvente relativamente no polar, como el hexano o el isopropiléter. Ahora a este tipo de cromatografía se le conoce como cromatografía en fase normal. En la cromatografía en fase inversa, la fase estacionaria es no polar, con frecuencia un hidro– carburo, y la fase móvil es un solvente relativamente polar, como agua, metano!, acetonitrilo o tetrahidrofurano. 14 En la cromatografía en fase normal, el componente menos polar se eluye primero; al aumentar la polaridad de la fase móvil ocasiona una disminución del tiempo de elución. En cambio, con la cromatografía de fase inversa, los componentes más polares aparecen primero y un aumento de la polaridad de la fase móvil incrementa el tiempo de elución. Estas correlaciones se ilustran en la figura 28.14. Como se puede ver en la figura 28.1, la cromato– grafía de partición de fase normal y la cromatografía de adsorción se traslapan en forma considerable. En efecto, la retención en la mayoría de los tipos de cromatografía en fase normal parece estar regida por procesos de desplazamiento de la adsorción. 15 Los rellenos de fase enlazada químicamente se llaman de fase inversa cuando el revestimiento enlazado tiene un carácter no '''Para una discusión más profunda sobre HPLC de fase inversa, véase L. R. Snyder, ). ). Kirkland y). L. Glajch, Practica/ HPLC Method Development, 2a. ed., New York: Wiley, 1997; A. M. Krstulovic y P. R. Brown, Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography, New York: Wiley, 1982. 15 Véase ). G. Dorsey et al., Anal. Chem., 1994, 66, SOOR, DOI: 10.1021/ac00084a019. polar, y de fase normal cuando el revestimiento contiene grupos funcionales polares. Se calcula que tal vez más de las tres cuar– tas partes de todas las separaciones que se realizan con HPLC se llevan a cabo en columnas con rellenos de fase reversa. La mayor ventaja de las separaciones en fase reversa es que se puede utilizar agua como fase móvil. El agua es un disolvente barato, libre de toxicidad y transparente a la radiación UV lo que la hace com– patible con disolventes biológicos. Asimismo, la transferencia de masa es rápida con fases estacionarias no polares, al igual que el equilibrado del disolvente después de la elución por gradiente. De manera común, el grupo R del siloxano en estos tipos de cober– tura es una cadena de (n-octil) de C 8 o de (n-octildecil) de C 18 • Hasta el momento no se conoce por completo el mecanismo por el cual estas superficies retienen moléculas de soluto. Al parecer, el mecanismo de retención es bastante complejo y muy diferente del reparto de la mayor parte de la fase porque la fase estacionaria no polar está anclada a un extremo. 16 Sin considerar con detalle el mecanismo de retención, un revestimiento enlazado se puede tra– tar como si fuera un líquido ordinario retenido físicamente. En la figura 28.15 se ilustra el efecto de la longitud de la cadena del grupo alquilo sobre la eficacia. Como era de esperar, las cadenas más largas originan rellenos que muestran una mayor retención, Además, una mayor longitud de la cadena permite una mayor cantidad de muestra. Por ejemplo, el tamaño máximo de muestra para un relleno de C 18 es casi el doble que para uno de C 4 en condiciones similares. En la mayoría de las aplicaciones de la cromatografía en fase inversa la elución se lleva a cabo con una fase móvil de elevada polaridad, por ejemplo, una disolución acuosa que contiene con– centraciones diversas de disolventes como metano!, acetonitrilo o tetrahidrofurano. De este modo, se debe poner especial cuidado en evitar valores de pH mayores de, aproximadamente, 7.5 porque la sílice tiene la capacidad de formar especies de silicato solubles, lo que ocasiona disolución de la fase estacionaria. Asimismo, en disolucio- 16 L. A. Cole y ). G. Dorsey, Anal. Chem., 1992, 64, 1317, DOI: 10.1021/ac00037a004; L. A. Cole, ). G. Dorsey y K. A. Dill, Anal. Chem., 1992, 64, 1324, DOI: 10.1021/ ac00037a005.