Principios de análisis instrumental

Sistema de HPLC Sistema de datos FIGURA 28.13 Diagrama de bloques de un sistema CL-EM. EL efluente de La columna de cromatografía de Líquidos se introduce en una fuente de ionización a presión atmosférica, como un electroaspersor o una fuente de ionización química. Los iones producidos se clasifican mediante el analizador de masas y son detectados por el detector de iones. ciones ordinarias de la cromatografía de líquidos de alta resolución. Las fuentes de ionización más comunes son la ionización por elec– troaspersión y la ionización química a presión atmosférica (véase la sección 20B). La combinación de cromatografía de líquidos de alta resolución y la espectrometría de masas ocasiona una alta selectivi– dad porque los picos no resueltos se pueden aislar al supervisar solo una masa seleccionada. La técnica de CL-EM tiene la capacidad de proporcionar huellas dactilares de un producto particular sometido a elución en lugar de confiar en el tiempo de retención como sucede en la HPLC ordinaria. La combinación también proporciona masa molecular, información estructural y análisis cuantitativo exacto. 12 En el caso de algunas mezclas complejas, la combinación de cromatografía de líquidos y espectrometría de masas no propor– ciona resolución suficiente. En años recientes se volvió posible aco– plar dos o más analizadores de masas para formar espectrómetros de masas en tándem (véase la sección 20C.5). Cuando se combi– nan con cromatografía de líquidos, los sistemas de espectrometría de masas en tándem reciben el nombre de instrumento de croma– tografía de líquidos-espectrometría de masas-espectrometría de masas. Por lo general, los espectrómetros de masas en tándem son sistemas cuadrupolares triples o espectrómetros cuadrupolares de trampa de iones. Con el fin de lograr una resolución superior a la que se consigue con un cuadrupolo, el analizador de masas final, en un sistema de espectrometría de masas en tándem, puede ser un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo. Los espectrómetros de masas de sectores también se pueden combinar para obtener sistemas en tándem. Los espectrómetros de masas de resonancia iónica de ciclotrón y de trampa de iones pueden trabajar de tal manera que proporcionen no solo dos etapas de análisis de masa, sino n etapas. Dichos sistemas de EM" (véase la sección 20C.5) proporcionan de manera sucesiva las etapas de análisis dentro de un analizador de masas sencillo. Éstos se han combinado con sis– temas de cromatografía de líquidos en instrumentos de CL-EM". Los sistemas de CL-EM ya son invariablemente compu– tarizados. Mediante estos instrumentos se pueden obtener tanto cromatogramas de tiempo real como los reconstruidos mediante computadora y los espectros de los picos eluidos. 12 Para una revisión de los sistemas comerciales de CL-EM consulte B. E. Erickson, Anal. Chem., 2000,72, 7IIA, DO!: 10.1021/ac0029758. })} 28D Cromatografía de partición 739 28D CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN El tipo de cromatografía de líquidos de alta resolución más ampliamente utilizado es la cromatografía de partición, en la cual la fase estacionaria es un segundo líquido que es inmiscible con la fase líquida móvil. La cromatografía de partición se subdivide en cromatografía líquido-líquido y cromatografía de Jase enlazada. La diferencia entre ambas radica en la manera en la que la fase esta– cionaria se mantiene unida a las partículas de soporte del relleno. El líquido se mantiene en su lugar mediante adsorción física en la cromatografía líquido-líquido, mientras que se mantiene unida químicamente en la cromatografía de fase enlazada. Al principio, en la cromatografía de partición se utilizaban columnas del tipo líquido-líquido. En la actualidad, predominan los métodos de fase enlazada debido a que poseen mayor estabili– dad y compatibilidad con la elución por gradiente. Los rellenos para cromatografía líquido-líquido se han relegado a unas cuantas apli– caciones. Por tanto, el enfoque se centrará exclusivamente en lacro– matografía de partición con fases enlazadas por medios químicos. 13 280.1 Columnas para cromatografia de fase enlazada quimicamente En cromatografía de partición, los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se preparan con sílice rígida o composiciones constituidas básicamente por sílice. Estos sólidos están formados por partículas mecánicamente resistentes, porosas y uniformes, con diámetros de 1.5 a 10 f.lm , pero las par– tículas de 3 a 5 f.lm son las más comunes. La superficie de la sílice totalmente hidrolizada (hidrolizada por calentamiento con HCl 0.1 M durante uno o dos días) está constituida por grupos silanol químicamente reactivos. Es decir, OH OH OH OH "'-1/ 0 "'-1/ 0 "'-1/ 0 "'-1/ Si Si Si Si 1 1 1 1 Las superficies características de sílice contienen cerca de 8 f!mol! m 2 de grupos OH y sus áreas superficiales son de lOO a 300 m 2 /g. Los revestimientos de fase enlazada químicamente más utili– zados son los siloxanos que se forman por reacción de la superfi– cie hidrolizada con un organoclorosilano. Por ejemplo, / /CH3 / /CH3 -Si -OH+ CI-Si -R->--Si-O-Si-R "-, "'\. CH3 "'\. "'\. CH3 donde Res un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido. El revestimiento de la superficie por silanización se limita a 4 f!mol!m 2 o menos a causa de los efectos estéricos. Por desgra– cia, los grupos SiOH que no han reaccionado proporcionan una polaridad indeseable a la superficie, lo que origina picos cromato- ce Tutorial: Aprenda más acerca de cromatografía de partición _ en www.tinyurl.com/skoogpia7* *Este material se encuentra disponible en inglés. 13 Para mayor información sobre los mecanismos de retención en cromatografía de fase enlazada químicamente, véase). G. Dorsey y W. T. Cooper, Anal. Chem., 1994, 66, 857A, DO!: 10.1021/ac00089a002.