Principios de análisis instrumental

736 Capítulo 28 Cromatograña de líquidos de alta resolución «< OHO ~O; ·OH o Dexametasona O OH o~ o 0. 146 Cortisona""' "' ¡j 0.096 "' -e o _e¡ 0.046 <( Corticosterona 0.004S:::::::::::~~~~~~~==------------------------J 11111l1 111!111111111 1111111111p111 1111111111111111 220 230 240 250 260 270 280 290 300 31 o 320 Longitud de onda, nm FIGURA 28.9 Espectros de absorción del eluyente de una mezcla de tres esteroides tomados a intervalos de 5 segundos. (Fuente: Agilent Technologies.) filtros han sido reemplazados por completo por espectrómetros de barrido y de arreglos de diodos. Detectores de absorción con capacidad de barrido. La mayoría de los fabricantes de instrumentos para cromatografía de líquidos de alta resolución ofrecen detectores que consisten en un espectrofotómetro de barrido con una red entre sus componentes ópticos. Algunos se limitan a la radiación ultravioleta y otros abar– can la radiación ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos de operación. Por ejemplo, se puede obtener el cromato– grama completo a una sola longitud de onda o también, cuando los picos del eluyente están suficientemente separados en el tiempo, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este caso debe emplearse el control por computadora para seleccionar la mejor longitud de onda para cada eluyente. Cuando se desean los espectros completos con fines de identificación, se puede detener el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el barrido de longitudes de onda de la región de interés. Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son los instrumentos de arreglos de diodos, como se señala en la sección 7E.3 y en la figura 13.25. 8 Varios fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, los cuales permiten recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente un segundo. Por consiguiente, los datos espectrales de cada pico cromatográ– fico se pueden recoger y almacenar a medida que aparecen al final de la columna. Una de las formas de presentación de los datos espectrales, que resulta útil para la identificación de las especies y para elegir las condiciones de la determinación cuantitativa, con– siste en un gráfico tridimensional tal como el que se muestra en la figura 28.9. En este caso los espectros se obtuvieron a intervalos sucesivos de 5 segundos. Es evidente la aparición y desaparición de cada uno de los tres esteroides en el eluyente. Detectores de absorción en el infrarrojo. Se ofrecen comer– cialmente dos tipos de detectores en el infrarrojo. El primero es un 8 Véase R. P. W. Scott, Chromatographic Detectors, New York: Dekker, 1996; Diode Arra y Detection in HPLC, L. Huber y S. A. George, eds., New York: Dekker, 1993. instrumento con filtro similar en cuanto a diseño al que se mues– tra en la figura 16.13. El segundo, mucho más complejo, es un tipo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier y es similar a los descritos en la sección 16B.l. Varios fabricantes de instrumentos IR con transformada de Fourier ofrecen accesorios que permiten usarlos como detectores en HPLC. Las celdas de los detectores del infrarrojo son semejantes a las de radiación ultra– violeta, excepto que las ventanas se construyen con cloruro de sodio o fluoruro de calcio. Las longitudes de la trayectoria de la celda oscilan de 0.2 a 1.0 mm y los volúmenes de 1.5 a 10 f1L. La principallimitante del uso de los detectores de infrarrojo radica en la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las anchas bandas de absorción del infra– rrojo del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de este detector en muchas aplicaciones. Asimismo, el uso de fases móviles acuosas ocasiona un deterioro rápido de los materiales de la celda a menos que se utilicen ventanas especiales. Los deficien– tes límites de detección de muchos solutos han limitado el uso de los detectores IR. La introducción de los detectores espectromé– tricos de masas para cromatografía de líquidos, que se tratan más adelante, ha ocasionado una declinación espectacular en las apli– caciones de la detección IR. Detectores de fluorescencia Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorómetros y espectrofluorómetros descritos en la sección 15B.2. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un transductor fotoeléctrico colocado a 90° res– pecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio y uno o más filtros para aislar una banda de la radiación emitida. Los instrumentos más complejos consisten en una fuente de xenón y emplean un mono– cromador de red para aislar la radiación fluorescente. La fluo– rescencia inducida por rayo láser también se utiliza debido a su sensibilidad y selectividad. Como se subrayó en el capítulo 15, una ventaja inherente de los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta