Principios de análisis instrumental

734 Capítulo 28 Cromatografía de líquidos de alta resolución <« 2 o 5 10 15 Tiempo, s FIGURA 28.7 Separación isocrática de alta velocidad. Dimensiones de la columna: 4 cm de longitud; 0.4 cm de diámetro interno; relleno: spheri– sorb de 3 ~m; fase móvil: 4.1% de acetato de etilo en n-hexano. Compues– tos: 1) p-xileno, 2) anisal, 3) acetato de bencilo, 4) ftalato de dioctilo, 5) ftalato de dipentilo, 6) ftalato de dibutilo, 7) ftalato de dipropilo, 8) ftalato de dietilo. (Tomada de R. P. W. Scott, Small Bore Liquid Chroma– tography Columns: Their Properties and Uses, New York: Wiley, 1984, p. 156. Reimpresa con autorización de John Wiley & Sons, Inc.) fase móvil y se le conoce como columna de desechos. El disolvente disuelve de manera parcial el empaquetamiento de sílica y asegura que la fase móvil se sature con ácido silícico antes de entrar en la columna analítica. Esta saturación minimiza las pérdidas de la fase estacionaria desde la columna analítica. Un segundo tipo de precolumna es la columna de guardia, posicionada entre el inyector y la columna analítica. La columna de guarda es una columna corta empacada con una fase estaciona– ria similar a la de la columna analítica. El propósito de la columna de guardia es prevenir que impurezas, como compuestos reteni– dos y partículas, alcancen y contaminen la columna analítica. La columna de guardia se reemplaza de manera regular y sirve para incrementar la vida media de la columna analítica. Control de la temperatura de la columna En algunas aplicaciones, no se necesita un control riguroso de la temperatura, por esa razón las columnas trabajan a tempera– tura ambiente. Sin embargo, muchas veces se obtienen mejores cromatogramas, más reproducibles, cuando la temperatura de la columna se mantiene constante. La mayoría de los instrumentos comerciales modernos están equipados con calentadores que con– trolan la temperatura de la columna con décimas de grado, desde la ambiental hasta 150 oc. Para poder controlar con precisión la temperatura, las columnas también se pueden colocar en cami– sas con agua que provenga de un baño a temperatura constante. Muchos operadores de cromatógrafos consideran que el control de la temperatura es esencial para lograr separaciones reproducibles. El control de temperatura es importante para la UHPLC por las mismas razones por las que es importante para la HPLC ordinaria, sin embargo, el calentamiento por fricción que resulta de las presiones ultra-altas crea gradientes de temperatura en la columna. Estos gradientes pueden minimizarse mediante un buen control de la temperatura, lo que lleva a un incremento en la esta– bilidad de la columna y a obtener separaciones altamente eficien– tes. Las temperaturas por encima de los 100 oc pueden llevar a la degradación de la columna, por lo que las temperaturas de opera- ción que se encuentran en el rango de 60 a lOO oc son buenas para llevar a cabo la UHPLC. 6 28C.5 Tipos de rellenos de La columna En cromatografía de líquidos se utilizan dos tipos básicos de relle– nos, pelicular y de partícula porosa. Las partículas peliculares ori– ginales eran cuentas esféricas de vidrio o de polímero no porosas cuyos diámetros característicos eran de 30 a 40 flm. En la super– ficie de éstas se depositaba una fina capa porosa de sílice, de alú– mina o de una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno, o bien, una resina de intercambio iónico. Las micropartículas poro– sas reemplazaron por completo a las partículas peliculares. En años recientes se han reintroducido rellenos peliculares (- 5 flm) para separar proteínas y biomoléculas grandes. Los rellenos de partículas porosas característicos para cro– matografía de líquidos están formados por micropartículas poro– sas cuyos diámetros varían entre 3 y 10 f.Lm; para un tamaño de partícula dado es deseable tener una distribución muy estrecha de dimensiones de partícula. Las partículas son de sílice, alúmina, de una resina sintética de poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio iónico. La sílice es el material de relleno más común en cromatografía de líquidos; las partículas se preparan aglutinando partículas de sílice de dimensiones inferiores al micró– metro en condiciones tales que se forman partículas mayores con diámetros muy uniformes. Las partículas que resultan se recubren muchas veces con películas orgánicas que se unen química o física– mente a la superficie. El relleno de las columnas para modos cro– matográficos específicos se estudia más adelante en este capítulo. 28C.6 Detectores No hay detectores para cromatografía de líquidos tan universal– mente aplicables como los detectores de ionización por flama y de conductividad térmica para cromatografía de gases que se des– cribieron en la sección 27B.4. Los detectores de cromatografía de gases fueron específicamente perfeccionados para medir peque– ñas concentraciones de analitos en flujos de gas. Por otro lado, los detectores de cromatografía de líquidos han sido instrumentos analíticos tradicionales adaptados con celdas de flujo para medir concentraciones bajas de solutos en flujos de líquidos. El pro– blema principal en el mejoramiento de la cromatografía de líqui– dos es la adaptación y perfeccionamiento de dichos dispositivos? Características del detector ideal El detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las características que se mencionan en la sección 27B.4 res– pecto a los detectores de cromatografía de gases, con excepción de que un detector de cromatografía de líquidos no requiere ser sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo con el fin de reducir el ensanchamiento de banda (sección 28B.2) y ser compatible con el flujo de líquidos. 6 S. Fekete et al., Trends A1wl. Chem., 2014,63, 2, DOI: 10.1016/j.trac.2014. 08.007. 'Para un análisis más detallado véase Liquid Chromatography: Fundamenta/s and Instrumentation, F. Salvatore, P. R. Haddad, C. Poole y D. K. Lloyd, eds., Bastan: Elsevier, 2013; R. P. W Scott, Chromatographic Detectors, New York: Dekker, 1996; R. P. W Scott, Liquid Chromatography Detectors, 2a. ed., Amsterdam: Elsevier, 1986.