Principios de análisis instrumental

computadora que permiten medir la tasa de flujo mediante la deter– minación de la caída de presión a través de un constrictor colocado en la salida de la bomba. Cualquier diferencia entre la señal y un valor preestablecido se utiliza para aumentar o disminuir la veloci– dad del motor de la bomba. Asimismo, la mayor parte de los instru– mentos puede variar la composición del disolvente sea de manera continua o de manera escalonada. Por ejemplo, el instrumento que se ilustra en la figura 28.3 contiene una válvula de alimentación que permite mezclar hasta cuatro disolventes de manera previa– mente programada y que varíe continuamente. 28C.3 Sistemas de inyección de muestra A menudo, el factor limitante en la precisión de las mediciones en cromatografía de líquidos es la reproductibilidad con que se pue– den introducir las muestras en el relleno de la columna. El pro– blema se acentúa por el ensanchamiento de banda que acompaña al tapón o sobrecarga de inyección. Por consiguiente, los volúmenes de muestra que se emplean tienen que ser muy pequeños, de unas pocas décimas de microlitro hasta quizás unos 500 ¡.tL. Además, lo apropiado es introducir la muestra sin despresurizar el sistema. El medio que más se usa para la introducción de las muestras en la cromatografía de líquidos se basa en los rizos de muestreo, como el que se ilustra en las figuras 28.6 y 27.5. Con frecuencia, estos dispositivos forman parte del equipo cromatográfico y hay asas intercambiables que permiten la elección de tamaños de muestra desde l hasta lOO ¡.tL o más. Con rizos de este tipo se Inyección de muestra FIGURA 28.6 Asa de muestreo para cromatografía de líquidos. Con la válvula en la posición que se muestra a la izquierda, la jeringa llena el rizo y la fase móvil pasa de la bomba a la columna. Cuando la válvula se coloca en la posición que se muestra a la derecha, el rizo queda insertado entre la bomba y la columna, de tal modo que la fase móvil arrastra la muestra hacia la columna. (Cortesía de Beck– man-Coulter, Inc.) }}) 28C Instrumentación 733 puede introducir la muestra a presiones de hasta 7000 psi con una desviación estándar relativa de unas décimas porcentuales. La mayor parte de los cromatógrafos actuales se venden con autoinyectores. Dichas unidades tienen la capacidad de inyectar muestras en el cromatógrafo de líquidos a partir de frascos que están en un carrusel o desde placas microtituladoras. Por lo regu– lar, contienen rizos de muestreo y una bomba de jeringa para inyectar volúmenes desde menos de l ¡.tL hasta más de l mL. Algunos poseen medios controlados por temperatura que facilitan el almacenamiento de la muestra y efectúan reacciones de deriva– ción antes de inyectarla. La mayor parte de los equipos se puede programar para facilitar las inyecciones automáticas en el sistema de cromatografía de líquidos. Los sistemas de UHPLC comercia– les tienen volúmenes de inyección que van de 0.1 a 50 ¡.tL. 5 28C.4 Columnas para cromatografia de liquidos de alta resolución Las columnas para esta técnica se construyen comúnmente con tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme. Algunas ocasio– nes las columnas para cromatografía de líquidos de alta resolución se fabrican con tubos de vidrio de paredes resistentes o con políme– ros como el polieteretercetona (PEEK, por sus siglas en inglés). Ade– más, también hay columnas de acero inoxidable cuyo interior está revestido con vidrio o polieteretercetona. Están disponibles cientos de columnas en diversos precios y rellenos; el costo de las que no son para un uso especial y cuyas dimensiones son estándares varía entre 200 y más de 500 dólares. Las columnas para un uso especial, como las quirales, pueden llegar a costar más de 1000 dólares. Columnas analíticas La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos miden de 5 a 25 cm de largo. Invariablemente se usan columnas rectas. A veces se pueden alargar acoplando dos o más de ellas. El diáme– tro interior de las columnas analíticas es a menudo de 3 a 5 mm; los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3 o 5 ¡.tm. Las columnas que más se utilizan miden de lO a 15 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro interior y están rellenas con par– tículas de 5 ¡.tm. Este tipo de columnas generan de 40 000 a 70 000 platos/metro (por lo regular, alrededor de lO 000 platos/columna). En los años ochenta se fabricaron microcolumnas cuyos diáme– tros interiores oscilaban entre l y 4.6 mm y sus longitudes iban de 3 a 7.5 cm. Estas columnas, que se rellenan con partículas de tamaño de 3 a 5 ¡.tm alcanzan hasta lOO 000 platos/metro y presentan la ven– taja de la rapidez y del mínimo consumo de disolvente. La última propiedad es de considerable importancia, puesto que los disolven– tes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son muy caros y se desechan después del uso. En la figura 28.7 se ilus– tra la rapidez con la que se puede realizar una separación con una columna de microdiámetro. En este ejemplo se separan ocho com– ponentes distintos en unos 15 s. La columna mide 4 cm de largo y su diámetro interior es de 4 mm; está rellena con partículas de 3 ¡.tm. Precolurnnas Hay dos tipos de precolumnas. Una precolumna entre el reser– vorio de la fase móvil y el inyector se utiliza para condicionar la 5 ). De Vos, K. Broeckhoven y S. Eeltink, Anal. Chem., 2016,88,262, DOI: 10.1021/ acs.analchem.Sb04381.