Principios de análisis instrumental

donde Les la longitud (por lo regular en centímetros) del relleno de la columna. La eficiencia de la columna cromatográfica aumenta cuanto mayor es el número de platos N y cuanto menor es la altura H del plato. Se han encontrado diferencias enormes en las eficiencias debido a diferencias en el tipo de columna y en las fases móvil y estacionaria. Las eficiencias en términos del número de platos varían desde pocos cientos a varios cientos de miles; no son poco comunes las alturas de plato que oscilan desde unas pocas décimas hasta una milésima de centímetro o menos. El origen de los términos "altura de plato" y "cantidad de pla– tos teóricos" proviene de uno de los primeros estudios teóricos realizado por Martin y Synge en el que trataron a una columna cromatográfica como si fuera similar a una columna de destila– ción que estuviera constituida por numerosas capas angostas o platos, distintos pero contiguos, a las que denominaron platos teó– ricos.6 Se suponía que en cada plato se establecía el equilibrio de la especie entre las fases móvil y estacionaria. El descenso del soluto por la columna se trataba entonces como una transferencia por etapas de fase móvil equilibrada de un plato al siguiente. La teoría del plato explica de manera satisfactoria la forma gaussiana de los picos cromatográficos y su velocidad de despla– zamiento por la columna. Pero la teoría se abandonó en favor de la teoría de la velocidad, debido a que la primera fallaba al intentar justificar el ensanchamiento de los picos de una manera meca– nicista. No obstante, los términos originales para la eficiencia se han incorporado a la teoría de velocidad. Esta nomenclatura es tal vez desafortunada porque tiende a perpetuar el mito de que una columna contiene platos donde hay condiciones de equilibrio. De hecho, el estado de equilibrio nunca se puede alcanzar con la fase móvil en movimiento constante. Definición de altura de plato Como se muestra en la sección a1B.1 del apéndice 1, la anchura de una curva gaussiana está directamente relacionada con su des– viación estándar u o su varianza u 2 . A menudo se supone que las bandas cromatográficas tienen una forma gaussiana, lo cual es conveniente para definir la eficiencia de una columna en términos de la varianza por unidad de longitud de la columna. Es decir, la altura de plato H viene dada por (26.17) Esta definición de la eficiencia de la columna se ilustra en la figura 26.6a, donde se muestra una columna con un relleno de L cm de longitud. Encima de este esquema (figura 26.6b) se puede ver una gráfica que representa la distribución de las moléculas a lo largo de la columna en el momento en que el pico del analito alcanza el extremo final del relleno (es decir, en el tiempo de retención). La curva es gaussiana y la ubicación deL + 1u y L - 1u se indica mediante líneas verticales discontinuas. Observe que las unida– des de L son centímetros y las de u 2 son centímetros cuadrados; entonces, H representa una distancia lineal en centímetros (ecua– ción 26.17). De hecho, puede pensarse en la altura de plato como la longitud de columna que contiene una fracción de analito com- 6 A. ). P. Martin y R. L. M. Synge, Biochem. f. , 1941,35, p. 1358, DO!: 10.1042/ bj0351358. »> 26( Ensanchamiento de banda y eficiencia de la columna 685 b) t Perfil de analito al final "' ¿;: "' u '<) o del empacamiento E (L- ICT) ~ ---- 1 2 "' (!"2 1 ~ H=y ) \_ L-----------------~--~~------~ L Di stancia migrada a) ¡ Empacamiento t tf-oo•c----- L ---~) Entrada de muestra ~ Detector FIGURA 26.6 Definición de la altura de plato H = 0" 1 /L. En a) la Longitud de La columna es La distancia desde el punto de entrada de La muestra hasta el máximo de señal del detector. En b) se muestra La distribución gaussiana de Las moléculas de La muestra. prendida entre L y L - u . Debido a que el área bajo una curva normal de error limitada por una desviación estándar (± 1u) es de alrededor de 68% del área total, la altura de plato, tal como se ha definido, contiene 34% del analito. La evaluación experimental de H y N La figura 26.7 ilustra un cromatograma característico con el tiempo en la abscisa. La varianza del pico del soluto, que se puede obtener por un procedimiento gráfico sencillo, tiene unidades de segundos al cuadrado y, por lo regular, se designa como T 2 para distinguirlo de u 2 , la cual tiene unidades de centímetros al cua– drado. Las dos desviaciones estándar T y u se relacionan mediante (J" T=-- L/tR (26.18) donde L/tR es la velocidad lineal promedio v del soluto en centí– metros por segundo (ecuación 26.4). La figura 26.7 ilustra una manera sencilla de determinar aproximadamente T y u a partir de un cromatograma experi– mental. Se trazan las tangentes en los puntos de inflexión a los dos lados del pico cromatográfico y se prolongan para formar un triángulo con la línea base del cromatograma. Se puede demos– trar que el área de este triángulo es casi 96% del área total bajo el pico, si éste es gaussiano. En la sección alB.1 del apéndice 1 se indica que casi 96% del área bajo un pico gaussiano se encuentra dentro del intervalo comprendido entre más o menos dos desvia– ciones estándar de su máximo (±2u). Entonces, las interseccio– nes que se indican en la figura 26.7 tienen lugar alrededor de más o menos dos desviaciones estándar (± 2T) respecto al máximo y W = 4T, donde W es la magnitud de la base del triángulo. Al sus– tituir esta relación en la ecuación 26.18 y reordenar los términos se tiene: LW u=- 4tR (26.19)