Principios de análisis instrumental

606 Capítulo 23 Potenciometría <« nes selectivas de ciertos iones de especies inorgánicas. Segundo, porque las reacciones catalizadas con enzimas se realizan en condi– ciones de temperatura y pH suaves y con mínimas concentraciones de sustrato. Tercero, porque al combinar la selectividad de la reac– ción enzimática y la respuesta del electrodo se obtienen resultados que están libres de la mayoría de las interferencias. La principal limitación de los procedimientos enzimáticos es el elevado costo de las enzimas, sobre todo cuando se utilizan para mediciones de rutina o continuas. Esta desventaja ha ocasionado el uso de medios enzimáticos inmovilizados, en los cuales una pequeña cantidad de enzima se puede utilizar para análisis conse– cutivos de cientos de muestras. En general se utilizan dos técnicas. En una, la muestra se hace pasar a través de un lecho fijo de enzi– mas inmovilizadas y, a continuación, al detector. En la segunda, se une directamente a la superficie del electrodo selectivo de iones una capa porosa de la enzima inmovilizada, con lo que se forma un electrodo enzimático. En tales dispositivos, el producto de la reac– ción alcanza la superficie de la membrana selectiva por difusión. La inmovilización de las enzimas se puede efectuar de diver– sas maneras, como la captura física en un gel de polímero; la adsorción física en un soporte inorgánico poroso, como la alú– mina; el enlace covalente de la enzima a una superficie sólida, como cuentas de vidrio o a un polímero; o la copolimerización de la enzima con un monómero adecuado. Un ejemplo de esta aplicación se maneja en la determinación de nitrógeno de urea en la sangre el cual es un importante estudio clínico de rutina para lo cual se emplean dos tipos de electrodos enzimáticos. En presencia de la enzima ureasa, la urea es hidroli– zada de acuerdo con la reacción 1l + 2H,O Uno de los electrodos es de vidrio y responde al ion amonio for– mado por la reacción que se observa en la parte superior de la ecuación 23.23. El segundo electrodo es una sonda de gas amo– niaco que es sensible al amoniaco molecular en equilibrio con el ion amonio. Por desgracia, ambos electrodos tienen limitaciones. El electrodo de vidrio responde a todos los cationes monovalentes y sus coeficientes de selectividad para el NH 4 + respecto al Na+ o el K+ son tales que se producen interferencias en la mayoría de los medios biológicos de interés, como la sangre. La sonda de gas amoniaco presenta otro problema, a saber, el pH de la sonda es incompatible con la enzima. La enzima requiere un pH alrede– dor de 7 para una actividad catalítica máxima, pero la respuesta máxima del sensor tiene lugar a un pH mayor que 8 a 9 (donde prácticamente todo el NH 4 + se ha convertido en NH 3 ). Por tanto, la sensibilidad del electrodo es limitada. Ambas restricciones se superan con un sistema enzimático de lecho fijo, en el que la muestra se bombea sobre la enzima a un pH de casi 7. La disolu– ción resultante se hace entonces alcalina y el amoniaco liberado se determina con ayuda de una sonda de gas amoniaco. En el TABLA 23.6 Biosensores potenciométricos basados en enzimas* f~¡'""<S''·.,- • .. ' ~ ·- '. ·;· .~. . - l:~a!ito · ··. , Enzima · Reacción Detectores de electrodos ~:~~,.~~:::,~-~~~~- .'.-~.;_ •___•___::__!_ ':_:·,___ •• selectivos de iones - Urea Ureasa Urea ------+ 2NH 3 + C0 2 Vidrio o polímero NH 4 + Sensor de gas NH 3 Polímero o vidrio H+ Creatina Creatininasa Creatina------+ N-metilhidantoína + NH 3 Polímero o vidrio NH 4 + sensor de gas NH 3 L- O D- L-o n-amino L(n) AA------+ RCOCOOH + NH 3 + Hp 2 Polímero o vidrio NH 4 + aminoácidos ácido oxidasas sensor de gas NH 3 L-glutamina Glutaminasa L-glutamina ------+ ácido glutámico + NH 3 Polímero o vidrio NH 4 + sensor de gas NH 3 Adenosina Adenosina Adenosina------+ inosina + NH 3 sensor de gas NH 3 Polímero o vidrio NH 4 + deaminasa L-glutamato Glutamato L-glutamato------+ GABA + C0 2 Sensor de gas C0 2 descarboxilasa Amigdalina ,6-glucosidasa Amigdalina------+ HCN + 2C 6 H 12 0 6 + benzaldehído CN de estado sólido Glucosa Glucosa oxidasa Glucosa+ 0 2 ------+ ácido glucónico + Hp 2 Polímero o vidrio H+ Penicilina Penicilinasa Penicilina ------+ ácido penicilinoico Polímero o vidrio H+ ' Tomada de E. Bakker y M. E. Meyerhoff en Encyclopedia ofElectrochemistry, A. ). Bard., ed., voL 9, Bioe/ectrochemistry, G. S. Wilson, ed., New York: Wiley, 2002, p. 305, con autorización.