Principios de análisis instrumental

500 Capítulo 20 Espectrometña de masas molecular <« descrito casi de manera simultánea por primera vez en 1988 por dos grupos de investigación: uno alemán y otro japonés. 8 Ya hay instrumentos comerciales para esta técnica. En la técnica MALDI una baja concentración del analito es dispersada de manera uniforme en una matriz sólida o líquida que está depositada en el extremo de una sonda de acero inoxida– ble, o colocada en una placa de metal. Esta última se coloca luego en una cámara de vacío y un rayo láser se enfoca sobre la muestra. Además de la MALDI con cámara de vacío ordinaria, también se ha descrito una que trabaja a presión atmosférica. 9 La matriz para MALDI debe absorber de manera intensa la radiación láser. Des– pués, la matriz y el analito son desorbidos y ionizados, lo que pro– duce un penacho de iones. Todo el proceso se ilustra en la figura 20.7. El tipo más común de analizador de masas que se usa con MALDI es el denominado de tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés) . Un espectro de masas obtenido con un instrumento MALDI-TOF se muestra en la figura 20.8. En este caso, el mate– rial de la matriz es ácido nicotínico y el analito es un anticuerpo monoclonal de un ratón, su masa molecular es de alrededor de 150000 Da. Observe que el espectro se caracteriza por un ruido de fondo muy bajo y la carencia absoluta de fragmentación del ion analito grande. Están presentes múltiples iones cargados así como picos de especies con dímeros y trímeros. El mecanismo de la formación del penacho de iones en MALDI no se entiende aún por completo, pero las opiniones dicen que tiene que ver con la absorción del rayo láser por parte de la matriz seguida de la transferencia de energía desde la matriz al analito. Después, se produce con la desorción del analito y la matriz. Se supone que el analito se desorbe como una molécula neutra, luego se ionizará por medio de reacciones de transferencia de protones. Estas reacciones se efectúan con iones protonados en la matriz y en una fase densa sobre la superficie donde se encuen– tra ésta. Es posible que una serie de reacciones fotoquímicas pro– duzca los iones de matriz protonados. En la tabla 20.4 se enlistan algunos de los materiales para la matriz que se utilizan en las biomoléculas junto con las longitudes de rayo láser que se han usado. Entre los rayos láser empleados se incluyen nitrógeno (337 nm) , Nd-YAG (266 y 355 nm) , excímero (308 nm), Er-YAG (2.94 flm) y C0 2 ( l 0.6 flm) . El método más común para preparar la muestra es la técnica de la gota seca, en la cual una gotita de la matriz con el analito es depositada en la plancha metálica y luego se seca. Por lo regular, la relación entre analito y matriz es 1:10 3 a 1:10 5 . Las concentra– ciones de analito están casi siempre en una escala de micromoles. Recientemente, la técnica MALDI se ha extendido a métodos de imágenes escaneando un rayo láser localizado sobre la muestra dispersada. 10 De esta manera, se han obtenido imágenes espectra– les de masas de una variedad de biopolímeros. 8 Véase M. Karas y F. Hillenkamp. Anal. Chem., 1988,60, p. 2299, DOI: 10.1021/ ac00171a028; K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshidda, y T. Yoshidda, Rapid Commun. Mass Spectrosc., 1988,2, p. 151, DOI: 10.1002/rcm.1290020802; F. Hil– lenkamp. M. Karas, y B. T. Chait, Anal. Chem., 1991, 63, p. 1193A, DOI: 10.1021/ ac00024a716. 9 Véase la sección 20B.S para otras técnicas de ionización por presión atmosférica. 10 Véase por ejemplo, S. M. Weidner y ]. Falkenhagen, Rapid Comm1111. Mass Spec– trom., 2009, 23, p. 653, DOI: 10.1002/rcm.3919; K. A. Lunsford, G. F. Peter, y R. A. Yost, Anal. Chem., 2011, 83, p. 6722, DOI: 10.1021/ac2013527. masas TOF Analizad:Jrde 'lf-----~ ·~----..J Rayo láser eo = Analito =Matriz • =Catión Plato de muestra .. " /Rejilla de extracción 1liJ!~arJCl!IIEII3!ii!GIBlliillillllill]lit:iiEI o .. Matriz desorbida 1 y '""" de'"""'" o " o FIGURA 20.7 Diagrama del proceso MALDI. El analito se dispersa de manera uniforme en una matriz que es colocada en una plancha metá– lica para muestras. Un rayo láser de pulsos choca contra la muestra y ocasiona la desorción de un penacho de matriz, analito y otros iones. El analito puede estar protonado, desprotonado o formar aductos antes de entrar en el analizador TOF. Fuentes de bombardeo rápido de átomos Las fuentes de bombardeo rápido de átomos (FAB, por sus siglas en inglés), también llamadas fuentes de iones secundarios líquidos, alguna vez fueron muy populares para producir iones para estu– dios de espectrometría de masas de especies polares de alta masa molecular. 11 Con este tipo de fuente, las muestras en un estado condensado, generalmente en una matriz de solución viscosa, se ionizan mediante bombardeo con átomos energizados (varios keV) de argón o xenón. Tanto los iones analitos positivos como los negativos se pulverizan desde la superficie de la muestra en un proceso de desorción. Este tratamiento proporciona un calen– tamiento de muestra muy rápido, lo que reduce la fragmentación de la muestra. La matriz líquida ayuda a reducir la energía reticu– lar, que debe superarse para desorber un ion de una fase conden– sada, y proporciona un medio para "curar" el daño inducido por el bombardeo. Las matrices exitosas incluyen: glicerol, tioglicerol, alcohol m-nitrobencílico, éteres corona (18-corona-6), sulfolano, 2-nitrofeniloctil éter, dietanolamina y trietanolamina. Se obtiene un rayo de átomos rápidos pasando iones acelera– dos de argón o xenón desde una fuente de iones, o pistola, a tra– vés de una cámara que contiene átomos de argón o xenón a una presión de aproximadamente 10- 3 Pa (lo-s torr) . Los iones de alta velocidad experimentan una reacción resonante de intercambio de electrones con los átomos sin pérdida sustancial de energía de traducción. Por lo tanto, se forma un haz de átomos energéticos. 11 Para más información, véase]. H. Gross. Mass Spectrometry: A Textbook, cap. 10, Heidelberg, Germany: Springer, 2011; ). T. Watson y O. D. Sparkrnan, Introduction to Mass Spectrometry, pp. 250-251, Chichester, UK: Wiley, 2007.