Principios de análisis instrumental

372 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia <« La fosforescencia a temperatura ambiente en disolución se ha observado en medios organizados que contienen micelas. Con las micelas, el analito se incorpora al núcleo de la micela, lo cual sirve para proteger el estado triplete. También se utilizan las moléculas de ciclodextrina, las cuales son polímeros en forma de dona. En la mayor parte de los experimentos a temperatura ambiente, los átomos pesados como Tl(I), Pb(II), Ag(I) y los iones haluro, se aprovechan para impulsar el cruce entre los sistemas. 15C.4 Detección de fluorescencia en cromatografia Liquida Las medidas de fotoluminiscencia representan un importante método para la detección y determinación de los componentes de una muestra cuando se extraen de una columna cromatográ– fica o de electroforesis capilar. La fluorescencia excitada mediante rayos láser es muy importante sobre todo para estas aplicaciones porque el rayo se puede enfocar con faci lidad a un tamaño del mismo orden que el diámetro de la columna. Las aplicaciones en cromatografía de líquidos y electroforesis capilar se tratan en los capítulos 28 y 30. 15C.5 Medición del tiempo de vida La medición del tiempo de vida en fluorescencia proporciona información relacionada con los procesos de desactivación de colisiones, velocidades de transferencia de energía y reaccione·s de estados excitados. Desde el punto de vista analítico, las medi– ciones del tiempo de vida también se usan para proporcionar más selectividad en el análisis de mezclas que contienen especies lumi– niscentes. En un principio, la medición de los tiempos de vida de la luminiscencia estaba restringida a sistemas fosforescentes, donde los tiempos de decaimiento eran suficientemente largos para permitir una medición fácil de la intensidad emitida en fun– ción del tiempo. En los años recientes, sin embargo, se ha vuelto rutinario medir velocidades de decaimiento de la luminiscencia en la escala de tiempo de la fluorescencia oo-s a < 10- 9 s). Se aplican dos enfoques ampli amente usados para medir el tiempo de vida, a saber, el enfoque del dominio del tiempo y el del dominio de lafrecuencia. En las mediciones en el dominio del tiem– po, se utiliza una fuente pulsada y se mide el decaimiento de la fluo– rescencia en función del tiempo. En el método del dominio de la frecuencia, se utiliza una fuente modulada de manera sinusoidal para excitar a la muestra. El desfase y la desmodulación de la emisión de fluorescencia respecto a la onda de excitación proporcionan la infor– mación acerca del tiempo de vida. Ya hay instrumentos en el comer– cio para poder aplicar ambas técnicas. 16 15C.6 Métodos de imágenes por fluorescencia En los años recientes, ya es posible combinar la espectroscopia de fluorescencia con la microscopia óptica para generar imáge– nes de fluoróforos presentes en matrices de complejos como célu- 16 Algunas obras que tratan las mediciones del tiempo de vida son: F. V. Bright y C. A. Munson, Anal. Chim. Acta, 2003, 500, p. 71, DO!: 10.1 016/50003-2670(03)00723-2; ). R. Lakowicz, Principies ofFluorescence Spectroscopy, 2a. ed., caps. 4 y 5, New York: Kluwer Academic Publishers/Plenum Press, 1999. las únicas. 17 En algunos casos, la fluorescencia intrínseca o nativa de biomoléculas se puede usar junto con microscopia para super– visarla dinámica en las células. 18 En ausencia de un fluoróforo nativo, los indicadores fluorescentes se pueden aprovechar para demostrar hechos biológicos. De particular interés es la llamada sonda iónica que cambia su espectro de excitación o de emisión al unirse a iones específicos como Ca2+ o Na +. Estos indicadores se usan para registrar fenómenos que tienen lugar en diferentes par– tes de las neuronas o para vigilar en forma simultánea la actividad de un grupo de neuronas. Por ejemplo, en neurobiología, el colorante Fura-2 se uti– liza para monitorear la concentración de calcio libre dentro de la célula después de la estimulación farmacológica o eléctrica. Al rastrear los cambios de fluorescencia en función del tiempo en sitios específicos de la neurona, los investigadores son capaces de determinar cuándo y dónde tiene lugar un fenómeno eléctrico que depende del calcio. Una célula que se ha estudiado es la neu– rona de Purkinje del cerebelo, la cual es una de las más grandes en el sistema nervioso central. Cuando esta célula se carga con el indicador fluorescente Fura-2, se pueden medir cambios claros en la fluorescencia, los cuales corresponden a potenciales de acción individuales del calcio. Los cambios se correlacionan con los sitios específicos en la célula por medio de técnicas de imágenes fluo– rescentes. En la figura 15.15 se ilustra a la derecha la imagen fluores– cente junto a los transitorios de fluorescencia registrados cuando el cambio en la fluorescencia respecto a la fluorescencia estable ó.FIF se correlaciona con los picos del potencial de acción del sodio. La interpretación de estas clases de patrones puede tener consecuencias importantes relacionadas con el conocimiento acerca de la actividad sináptica. Hay diferentes fabricantes de microscopios comerciales de fluorescencia y sus accesorios. Los métodos de microscopia de fluorescencia y tiempo de vida de la fluorescencia se combinan en una técnica conocida como imágenes del tiempo de vida de la fluorescencia. En este caso, los tiempos de vida se utilizan para generar contraste en imágenes bidimensionales de fluorescencia. 19 15D QUIMIOLUMINISCENCIA La aplicación de la quimioluminiscencia a la química analítica es reciente. Las reacciones químicas que producen quimiolumi– niscencia son pocas, lo que limita el procedimiento a un número relativamente pequeño de especies. No obstante, algunas de las sustancias que reaccionan manifestando quimioluminiscencia son componentes importantes del ambiente. Para estos casos, la alta selectividad, la sencillez y la extrema sensibilidad del método son la causa de su utilización creciente. 20 17 X. F. Wang, B. Herman, eds., Fluorescence Imaging Spectroscopy and Microscopy, New York: Wiley, 1996. 18 Por ejemplo, véase, E. S. Yeung, Anal. Chem., 1999, 71, p. 522A, DO!: 10.1021/ac9906025. 19 Por ejemplo, véase,). R. Lakowicz, Principies of Fluorescence Spectroscopy, 2a. ed., New York: Kluwer Academic Publishing/Plenum Press, 1999; B. Herman, Fluores– ce¡¡ce Microscopy, 2a. ed., New York: Springer-Verlag, 1998. 20 Refíérase a las obras siguientes si desea repasar la quimioluminiscencia y consul– tar algunas aplicaciones analíticas, S. Das el al., Anal. Chem., 20 12,84, p. 597, DO!: 10.1021 /ac202904n y revisiones previas en Analytical Chemistry; T. A. Nieman, en Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, F. A. Settle, ed., cap. 27, Upper Saddle River, Nj: Prentice-Hall, 1997.