Principios de análisis instrumental

Compensación de la fuente Los dos instrumentos para luminiscencia mostrados en las figuras 15.1Oy 15.11 controlan la intensidad de la fuente a través de un fotomultiplicador de referencia. Lo más común es que la relación entre la señal de luminiscencia de la muestra y la señal procedente del detector de referencia se determine en forma continua. Esto puede compensar las fluctuaciones de la intensidad de la fuente y la deriva. Se aplican tanto el diseño de doble haz en el espacio como el doble haz en el tiempo. Espectros de excitación corregidos La compensación de la fuente no corrige la dependencia de la longitud de onda respecto de la fuente ni los rendimientos de los componentes ópticos, ni del selector de la longitud de onda de excitación. La corrección de estos efectos se puede realizar de varias maneras. En algunos instrumentos comerciales se utiliza un contador de cuantos. Éste es una celda de referencia llena con un fluoróforo concentrado de eficacia cuántica alta, como Rhoda– mina B. Una solución de 3 a 8 g/L de glicerol absorbe en esencia toda la luz incidente desde 220 a 600 nm. La eficacia cuántica es virtualmente constante en este intervalo de excitación. El haz de excitación se divide después del selector de longitud de onda, y una fracción excita el material de referencia. La misma distribu– ción del espectro de emisión resulta de todas las longitudes de onda de excitación, de modo que no hay que preocuparse por la respuesta espectral del fotomultiplicador. La señal de referencia resultante es directamente proporcional a la potencia radiante de la fuente que choca contra la muestra. Con frecuencia, los espectrofluorómetros computarizados modernos alcanzan una corrección similar al guardar el espectro de referencia de la fuente en la memoria de la computadora. Des– pués de escanear el espectro de muestra, se realiza la corrección mediante el cálculo de la relación entre el espectro de la muestra y el espectro de referencia. Un ejemplo de las diferencias entre espectros corregidos y no corregidos se proporciona en la figura 15.13. Un espectro de exci– tación corregido en forma apropiada debe ser idéntico al espectro de absorción del mismo compuesto. Espectros de emisión corregidos Los espectros de emisión reunidos en diferentes instrumentos varían debido a la dependencia de las longitudes de onda de los selectores y transductores. La forma de un espectro de emisión corregido de manera apropiada refleja cómo el rendimiento de la luminiscencia varía respecto a la longitud de onda de la excita– ción, como se muestra en la figura 15.13. Para corregir el espectro de emisión, se utiliza una fuente de luz calibrada y se determinan los factores de calibración del monocromador de emisión y del transductor; éstos se guardan en la memoria de la computadora. Los resultados de la emisión sin corregir se multiplican por facto– res de corrección apropiados para obtener el espectro corregido. 158.4 Calibración del instrumento Debido a las variaciones de la intensidad de la fuente, la sensibili– dad del transductor y otras variables instrumentales, es imposible obtener exactamente las mismas lecturas con un fluorómetro o con un espectrofotómetro para una disolución o un conjunto de ))) 15( Aplicaciones de los métodos fotoluminiscentes 369 - Corregida - No corregida Excitación Emisión 200 250 300 350 400 450 500 550 600 Longitud de onda. nm FIGURA 15.13 Espectros corregidos y sin corregir del sulfato de qui– nina en H 1 50 4 0.2 M. Observe que el espectro de excitación corregido manifiesta una intensidad más alta en la región de longitud de onda corta (-250 nm) que en la región de longitud de onda más larga (-350 nm) porque la absortividad molar de la banda de 250 nm es más grande. El espectro de excitación no corregido muestra una intensidad mucho más baja en la región de 250 nm porque la potencia radiante de la fuente es baja . La banda de 350 nm es de intensidad superior en el espectro sin corrección debido a la potencia radiante alta de la fuente. (Tomada de NIST Tech. Nota 584, p. 55, diciembre de 1971.) disolución de un día a otro. Por esta razón, es una práctica común calibrar el instrumento y ajustarlo a un nivel de sensibilidad reproducible. La calibración se efectúa casi siempre con una diso– lución estándar de un fluoróforo estable. El reactivo más común para este cometido es una disolución patrón de sulfato de quinina cuya concentración sea casi 10- 5 M. Por lo general, se excita con una radiación de 350 nm y emite radiación a 450 nm (véase la figura 15.13). Se ha descrito el uso de otros compuestos para otras regiones de longitudes de onda. Varios fabricantes de instrumentación ofrecen un conjunto de estándares de fluorescencia. En algunos casos, éstos están disueltos en una matriz de plástico, que forman unos bloques sóli– dos estables y que se pueder¡¡utilizar de manera indefinida sin un almacenamiento ~special. Con estos patrones, el instrumento se calibra con facilidad en la región de longitudes de onda que se uti– lizará en el análisis. La comparación de los espectros de fluorescencia entre dis– tintos instrumentos se debe efectuar sólo con espectros corregi– dos, como se explicó en la sección 15B.3. 15C APLICACIONES DE LOS MÉTODOS FOTO LUMINISCENTES Los métodos fluorescentes y fosforescentes tienen límites de detección más bajos que las mediciones espectrofotométricas de absorción. Dichos métodos se encuentran entre las técnicas ana– líticas más sensibles de las que pueden disponer los científicos. El