Principios de análisis instrumental

366 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia «< rometría también se utilizan los dispositivos de transferencia de carga, como los de acoplamiento de carga. 3 Este tipo de transduc– tor facilita el registro rápido tanto de los espectros de excitación como de los de emisión, y sobre todo es útil en cromatografía y en electroforesis. Celdas y compartimientos para las celdas Para mediciones de fluorescencia se utilizan celdas o cubetas tanto cilíndricas como rectangulares, fabricadas con vidrio o con sílice. Se debe tener cuidado en el diseño del compartimiento de la celda para reducir la cantidad de radiación dispersa que llega hasta el detector. A menudo se introducen deflectores en el com– partimiento con este propósito. Más importante aún que en las medidas de absorbancia, es evitar dejar huellas dactilares en las celdas, ya que la grasa de la piel con frecuencia manifiesta fluorescencia. Las microceldas de bajo volumen se utilizan cuando el volu– men de la muestra es limitado. Varias compañías fabrican cel– das de flujo para detección de fluorescencia en cromatografía y en análisis de flujo continuo. Entre los accesorios para manejar las muestras están los lectores de microplaca, accesorios para el microscopio y sondas de fibra óptica. Por lo regular, las celdas de bajo volumen se utilizan en fosforescencia y quimioluminiscencia a temperatura ambiente. Se necesitan celdas y manejo de muestras para efectuar las mediciones de fosforescencia a baja temperatura. Aunque la configuración de ángulos rectos que se muestra en la figura 15.8 es la más común, se utilizan también otras dos con– figuraciones de celdas. El acomodo de superficie frontal facilita las mediciones en disoluciones con absorbancias altas o en sóli– dos opacos. La disposición de 180°, o en línea, se usa muy poco porque el selector de longitud de onda de la emisión debe aislar la señal débil de luminiscencia del intenso haz de excitación. 3 R. S. Pomeroy en Charge Transfer Devices in Spectroscopy, ). V. Sweedler, K. L. Rat– zlaff y M. B. Denton, eds., New York: VCH, 1994, pp. 281-314; P. M. Epperson, R. D. }alkian y M. B. Denten, Anal. Chem., 1989,61, p. 282, DOI:IO.I021/ac00178a020. Organización de la información Los instrumentos modernos para luminiscencia computariza– dos poseen diferentes programas de computación con esquemas para manejar los datos. El manejo de información común y las opciones para mostrar los datos incluyen la sustracción de la señal blanco, corrección de espectros de excitación y de emisión, cálculo y despliegue de los espectros de diferencias y de derivadas, detección de máximos y procesamiento, desconvolución, produc– ción de gráficas tridimensionales de luminiscencia total, ajuste de datos de calibración, cálculo de parámetros estadísticos y suavi– zación de espectros por medio de diversos métodos. Hay progra– mas especializados disponibles para cinética, detección mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC), análisis de mezclas y mediciones temporales. 158.2 Diseños de instrumentos Fluorómetros Los fluorómetros de filtro proporcionan una manera relativa– mente simple y barata de realizar análisis cuantitativos por fluo– rescencia. Como ya se señaló, para seleccionar las longitudes de onda de la radiación de excitación y de emisión se utilizan filtros de interferencia y de absorción. Casi siempre los fluorómetros son compactos, resistentes y fáciles de usar. En la figura 15.1 0 se muestra el esquema de un fluoróme– tro de filtros característico que utiliza una lámpara de mercurio para excitar la fluorescencia y un par de tubos fotomultiplicadores como transductores. El haz que sale de la fuente se divide cerca de ella en un haz de referencia y en un haz de la muestra. El haz de referencia se atenúa mediante el disco de apertura hasta que su intensidad es casi igual que la de la fluorescencia. Ambos haces pasan a través del filtro primario y, a continuación, el haz de refe- ~ Tutorial: Aprenda más acerca de los instrumentos para ..Y:;;! fluorescencia en www.tinyurl.com/skoogpia7* *Este material se encuentra disponible en inglés. Q Lámpara 1 111 1 111 1 111 Disco de 9 f\f' apertura de Obturador 11 la muestra 1 ~ 111 A'~' ' 1 1:: ' Filtro . Fotomultiplicador Filtro : ~ pnmanodde referencia Fotomultiplicador secundario ~ F O de '' m"O~= fl\ -~ -111~::::~ t~~--~ W-- ~-~ Muestra Disco de E D apertura de referencia FIGURA 15.10 Un fluorómetro típico. (Cortesía de Farrand Optical Components and Instruments Division of Ruhle Companies, Inc.)