Principios de análisis instrumental

Longitud de onda de excitación, nm 300 350 40 t 1 a) r J "O .~ u '" ~ "O '(ij ~ ~ ~ :::-o ~ ~ ..:; o " 11 a:: b) 1 300 350 40 Longitud de onda de emi sión , nm FIGURA 15.9 Espectros de fluorescencia para 1 ppm de antraceno en alcohol: a) espectro de excitación; b) espectro de emisión. 15B.1 Componentes de los fluorómetros y de los espectrofluorómetros Los componentes de los fluorómetros y de los espectrofluoróme– tros son muy similares a los que se han descrito para los fotómetros y espectrofotómetros de absorción. No obstante, hay varias dife– rencias que se tratan aque Fuentes Como se muestra en la ecuación 15.6, la magnitud de la señal de salida en las mediciones de luminiscencia y, por tanto, en la sen– sibilidad, es directamente proporcional a la potencia de la fuente radiante P 0 • Por esta razón, se usan fuentes más intensas en los métodos luminiscentes y ya no las lámparas de tungsteno o deute– rio que se emplean en las mediciones de absorción. Lámparas. La lámpara más común para los fluorómetros de fil– tro es una de vapor de mercurio a baja presión equipada con una ventana de sílice fundida . Esta fuente produce líneas útiles para excitar la fluorescencia a 254, 302, 313, 546, 578, 691 y 773 nm. Cada una de las líneas se puede aislar con filtros de inter– ferencia o absorción apropiados. Debido a que la fluorescencia se puede inducir en la mayoría de los compuestos fluorescentes mediante una diversidad de longitudes de onda, por lo menos una de las líneas del mercurio es adecuada. 1 Si desea un panorama de los instrumentos de fluorescencia comerciales, refiérase a ). Kling, Anal. Chem., 2000,72, p. 219A, DOI:l0.!021 /ac002755u. ))) 15B Instrumentos para medir fluorescencia y fosforesce ncia 365 Para los espectrofluorómetros en los que se requiere una fuente de radiación continua, se utiliza normalmente una lámpara de arco de xenón de alta presión de 75 a 450 W. Éstas requieren una fuente de alimentación potente, capaz de producir corrientes continuas de 5 a 20 A y de 15 a 30 V. El espectro de una lámpara de arco de xenón es continuo desde alrededor de 300 a 1300 nm. El espectro se aproxima al de un cuerpo negro (véase la figura 6.22). En algunos instrumentos se obtienen destellos espaciados en forma regular en el tiempo mediante la descarga de un con– densador a través de la lámpara a una frecuencia constante; se consiguen intensidades de picos superiores mediante pulsos. Ade– más, las salidas de los transductores son luego señales de ca que pueden amplificarse y procesar con facilidad. En los instrumentos de fluorescencia también se usan los diodos emisores de luz azul (LEDs). Estas lámparas emiten radia– ción a 450-475 nm y son apropiadas para excitar algunos fluo– róforos. Las mezclas de luminóforos en algunos LEDs pueden proporcionar longitudes de onda en la región UV a alrededor de 375 nm (véase la sección 13D.1). Rayos láser. Desde comienzos de los años setenta se utilizan también diversos tipos de rayos láser como fuentes de excita– ción para medir la fotoluminiscencia. Son de particular interés los rayos láser sintonizables y de colorante que utilizan como sis– tema de bombeo un rayo láser de nitrógeno pulsante o un láser de granate de itrio-aluminio dopado con neodimio (Nd-YAG). Los rayos láser de longitud de onda fija también se usan, sobre todo, en los detectores para cromatografía y electroforesis. La mayoría de los espectrofluorómetros comerciales usan lámparas como fuentes por ser menos caras y menos complicadas para determinar múltiples analitos con diferentes longitudes de onda de excitación. Sin embargo, las fuentes de rayos láser ofre– cen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, 1) cuando las muestras son muy pequeñas, como en la croma– tografía con microcolumnas y en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es un microlitro o menos; 2) en los sensores de control remoto, como en la detección fluorométrica de radicales hidroxilo en la atmósfera o de clorofila en lagos o lagunas, donde la naturaleza colimada de los haces de láser es fundamental; o 3) cuando se requiere una radiación de excitación altamente monocromática para reducir al mínimo los efectos de las interfe– rencias fluorescentes. Filtros y rnonocrornadores Los filtros de interferencia y de absorción se utilizan en los fluo– rómetros para seleccionar la longitud de onda tanto del haz de excitación, como de la radiación fluorescente resultante. Los espectrofluorómetros están equipados con al menos uno y a menudo dos monocromadores de red. Transductores Las señales de emisión de luminiscencia son típicamente de muy baja intensidad. Por tanto, se requieren transductores sensibles. Los tubos fotomultiplicadores son los transductores que más se utilizan en instrumentos de fluorescencia sensibles. Con frecuen– cia, funcionan en la modalidad de recuento de fotones para mejo– rar la relación señal-ruido (véase la página 184); con este mismo fin, a veces los transductores se refrigeran. En la espectrofluo-