Principios de análisis instrumental

364 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia <« 15B INSTRUMENTOS PARA MEDIR FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA Los componentes de los instrumentos para medir la fotoluminis– cencia son similares a los de los fotómetros o espectrofotómetros ultravioleta-visible. La figura 15.8 muestra una configuración típica de estos componentes en los fluorómetros y los espectro– fluorómetros. Casi todos los instrumentos para la medición de la fluorescencia utilizan equipo óptico de doble haz, tal como se muestra, para compensar las fluctuaciones en la potencia radiante. El haz de la muestra superior pasa primero a través de un selector de longitud de onda de excitación (filtro o monocromador) que transmite la radiación que causa la fluorescencia, pero excluye o limita la radiación de la longitud de onda de emisión de fluo– rescencia. La fluorescencia se emite desde la muestra en todas las direcciones, pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de excitación. La geometría en ángulo recto reduce al mínimo las contribuciones de la dispersión y de la radiación intensa de la fuente. La radiación emitida atraviesa un selector de longitud de onda de emisión (filtro o monocromador) que aísla la emisión de fluorescencia. La radiación aislada choca entonces contra un fototransductor, en donde es transformada en una señal eléctrica para poderla medir. El haz de referencia más bajo pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente (por lo regular, la potencia se reduce en un factor de 100 o más). El haz de referencia atenuado choca luego contra un segundo transductor y se convierte en una señal eléctrica. El equipo electrónico y un sistema de datos computarizado procesan entonces las señales para calcular la relación entre la intensidad de la emisión fluorescente y la intensidad de la fuente de excitación, y producen el espectro resultante o los datos de longitud de onda. La complejidad, las características de funcionam iento y el precio de los fluorómetros y de los espectrofluorómetros, difieren tanto entre sí como ocurre con los correspondientes instrumentos Muestra o -- Haz de la t muestra ,---'------, r o Haz de referencia Fuente Atenuador del haz para las mediciones de absorción. Si solo se utilizan filtros para seleccionar la longitud de onda, el instrumento es un fluoróme– tro . Los espectrofluorómetros están equipados con dos monocro– madores para aislar la longitud de onda. Algunos instrumentos son híbridos porque usan un filtro para seleccionar la longitud de onda de excitación y un monocromador para elegir la longi – tud de onda de emisión. A menudo se les llama todavía espec– trofluorómetros. Se pueden comprar varios espectrofotómetros comerciales con adaptadores que permiten su uso como espectro– fluorómetros. Los verdaderos espectrofluorómetros permiten la produc– ción de un espectro de excitación de la fluorescencia o un espec– tro de emisión de fluorescencia. La figura 15.9a muestra un espectro de excitación del antraceno en el que la emisión fluorescente se midió a una longitud de onda fija, mientras se barría la longitud de onda de excitación. Si se efectúan las correcciones adecuadas para compensar las variaciones de la intensidad de la seña l de salida de la fuente y de la respuesta del detector en función de la longitud de onda, se obtiene un espectro de excitación absoluto que se asemeja mucho a un espectro de absorción. En la figura l5.9b se ilustra el espectro de emisión de fluo– rescencia del antraceno. El espectro se obtuvo manteniendo constante la longitud de onda de excitación mientras se hacía un escaneo de las longitudes de onda de la emisión. Estos dos espec– tros son casi imágenes especulares entre sí porque las diferencias de energía vibracional para los estados electrónicos fundamental y excitado son más o menos las mismas (véase la figura 15.2). La selectividad que proporcionan los espectrofl uoróme– tros es muy importante en las investigaciones relacionadas con las características electrónicas y estructurales de las moléculas y valiosa en los trabajos analíticos cualitativos y cuantitativos. Sin embargo, para mediciones de concentración, los fluorómetros, relativamente baratos, son suficientes. Por lo regular, se diseñan específicamente para resolver los problemas de medición pro– pios de los métodos fluorescentes, y son a menudo tan especí– ficos y selectivos como los espectrofotómetros de absorción modificados. FIGURA 15.8 Partes de un fluorómetro o espectrofluorómetro. La fuente de radiación se divide en dos haces. El haz de la muestra pasa por el selector de longitud de onda de excitación y llega a la muestra. El selector de la longitud de onda de la emisión aísla la fluorescencia emitida antes de que choque contra el transductor. El haz de referencia es atenuado antes de chocar co ntra el transductor. El equipo electrónico y el sistema de cómputo calculan la relación entre la intensidad de la fluorescencia y la intensidad del haz de referencia, lo cual anula el efecto de las fluctuaciones de la intensidad de la fuente.