Principios de análisis instrumental

362 Capítulo 15 Espectrometría molecular por luminiscencia «< A B e D E F 1 G 1 H 1 1 l J 1 Supresión de fluorescencia 1 J 1 1 2 F [Cr] FrJF 3 180.0 0.000 1.0000 14 4 87.5 0.005 2.0571 y = 209.95x + 1.0092 5 58.0 0.010 3.1034 12 6 43.2 0.015 4.1667 R 2 = 0.9999 10 7 35.0 0.020 5.1429 8 28.5 0.025 6.3158 !:!:: 8 9 24.5 0.030 7.3469 U.. o 6 10 19.1 0.040 9.4241 11 15.7 0.050 11.4650 4 12 Pendiente 209.9462 1.009155 Intersección 2 13 DS pendiente 0.868963 0.023127 DS intersec. 14 R2 0.99988 0.040292 S o 15 F 58373.19 7 df 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 16 SSregresión 94.7664 0.011364 SSresid [Cil 17 18 Documentación de la hoja de cálculo 19 Cell D3=$B$3/B3 l l J 1 20 Celis B12:C16=LINEST(D3:D11 ,C3:C11 ,1,1) 1 1 1 1 FIGURA 15.4 Hoja de cálculo y gráfica para determinar la constante de amortiguamiento en el caso del ion cloruro como agente supresor de la quinina. A menudo, la presencia de oxígeno disuelto reduce la intensi– dad de la fluorescencia de una disolución. Algunas veces este efecto es resultado de una oxidación fotoquímica de la especie fluorescente. Pero lo más común es que la supresión o amortiguamiento sea oca– sionado por las propiedades paramagnéticas del oxígeno molecular, lo cual promueve el cruce entre sistemas y la conversión de moléculas excitadas al estado triplete. Otras especies paramagnéticas también tienden a atenuar la fluorescencia. El oxígeno disuelto es un agente supresor eficaz del estado triplete. Por esta razón, las disoluciones se desoxigenan antes de efectuar las mediciones de fosforescencia. Otros tipos de supresión En el caso de la supresión estática, el agente supresor y el fluoró– foro en estado fundamental, forman un complejo llamado com– plejo oscuro. Por lo regular, la fluorescencia se observa solo en un fluoróforo no enlazado. La disminución de la intensidad de la fluorescencia también se puede describir mediante la ecuación de Stern-Volmer en el caso de la supresión estática. No obstante, Kq de la ecuación 15.11 es ahora la constante de formación del com– plejo fluoróforo -agente supresor. Con la supresión estática no se afecta el tiempo de vida; por tanto, las mediciones del tiempo de vida facilitan la distinción entre la supresión dinámica y la supre– sión estática. En la supresión o amortiguamiento amplio o de Fi:irster, la transferencia de energía ocurre sin que choquen las moléculas. El acoplamiento dipolo-dipolo entre el fluoróforo excitado y el agente supresor explica la transferencia. La dependencia del grado de supresión respecto a la concentración es complicada y no se apega al comportamiento de Stern-Volmer. 15A.5 Espectros de emisión y de excitación En la figura 15.5 se muestran tres tipos de espectros fotoluminis– centes del triptófano. El espectro de excitación E de la figura se obtiene midiendo la intensidad de la luminiscencia a una longitud 200 300 400 500 600 Longitud de onda, nm FIGURA 15.5 Espectros del triptófano: E, excitación; F, fluorescen– cia; P, fosforescencia. (Adaptada de G. G. Guilbault, Practica/ Fluo– rescence, New York: Maree[ Dekker, 1973, p. 164. Cortesía de Maree[ Dekker, Inc.) de onda fija mientras se varía la longitud de onda de excitación. Como la primera etapa en la generación de emisión fluorescente es la absorción de radiación para crear los estados excitados, el espectro de excitación es en esencia idéntico a un espectro de absorción obtenido en las mismas condiciones. Por otro lado, los espectros de fluorescencia y de fosforescencia (F y P, respectiva– mente), requieren excitación a una longitud de onda fija mientras se registra la intensidad de emisión en función de la longitud de onda.