Principios de análisis instrumental

338 Capítulo 14 Aplicaciones de la espectrometría por absorción molecular en las regiones ultravioleta-visible <« Los métodos cinéticos pueden ser más selectivos que los de equilibrio si los reactivos y las condiciones se escogen de tal manera que se lleven al máximo las diferencias en las velocidades a las cua les reaccionen el analito y los posibles interferentes. En los métodos que se basan en el equilibrio, la selectividad se efec– túa al aumentar las diferencias en las constantes de equilibrio. 14F.1 Tipos de reacciones En los métodos cinéticos se pueden emplear diversos tipos de reacciones. Las reacciones catalizadas están entre las más popula– res; en ellas se determina un catalizador de acuerdo con la manera en que influye en la velocidad de reacción, o bien, se elige uno de los reactivos. Por ejemplo, el yoduro es un catalizador en la reac– ción de Ce(IV) con As(III). Las cantidades traza de r- se pueden determinar al medir la velocidad de esta reacción en función de la concentración der - . Por lo regular, se usa el método de patro– nes externos para preparar una curva de calibración de velocidad contra concentración de yoduro. Más de 40 cationes inorgánicos y más de 15 an iones se han determinado con base en su efecto catalítico. También, mediante métodos cinéticos se han determinado catalizadores orgánicos. Las aplicaciones más importantes de las reacciones catalizadas en los análisis orgánicos requieren el uso de enzimas como catalizadores. El comportamiento de una gran cantidad de enzimas es compatible con el mecanismo general k, k, E+ S~ES ~ P +E (14.5) L l En este denominado mecanismo de Michaelis-Menten, la enzima E reacciona en forma reversible con el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato (ES). Entonces, este complejo se des– compone en forma irreversible para crear los productos y la enzima regenerada. Con frecuenci a, la velocidad de esta reacción cumple con la ley de la velocidad d [P] dt k 2 [E] 0 [S] K,+ [S] (14.6) donde K, es la constante de Michaelis (L 1 + k 2 )/k 1 • En estas con– diciones, donde la enzima está saturada con sustrato, [S] ¡, Km, la velocidad d[P]Idt es directamente proporcional a la concentra– ción inicial de la enzima [E] 0 : d[P] - = k2[E]o dt Por tanto, las mediciones de la velocidad se pueden usar para obtener la actividad de la enzima (concentración), [E] 0 . Asimismo, los sustratos pueden determinarse mediante métodos cinéticos. En estas condiciones en las que [S] ~ Km, la ecuación 14.6 se reduce a donde k' = k 2 / K",. En este caso, la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato [S]. Si las medidas se toman cerca del inicio de la reacción (<S% de la reacción), [S] = [S] 0 y la velocidad es directamente proporcional a la concentración inicial del sustrato. 21 Las regiones donde la enzima y el sustrato pueden determi– narse por medio de métodos cinéticos están ilustrados en la figura 14.14, en la que se puede ver una gráfica de velocidad inicial con– tra concentración del sustrato. Puede observarse que la velocidad inicial es proporcional a la concentración del sustrato a muy bajas concentraciones, pero la velocidad es proporcional a la concen– tración de la enzima cuando la concentración del sustrato es muy alta. Además de las reacciones catalizadas, los métodos cinéticos de análisis también se pueden aplicar en reacciones no cataliza– das. Por ejemplo, se puede determinar el fosfato al medir la velo– cidad de su reacción con el molibdato para formar una especie heteropoli, 12-molibdenofosfato. Se puede alcanzar más sensi– bilidad reduciendo el 12-molibdenofosfato con ácido ascórbico u otro agente reductor para formar azul de fosfomolibdeno, una especie intensamente coloreada. En cualquier caso, la velocidad de formación del producto es directamente proporcional a la con– centración del fosfato. 14F.2 Instrumentación Los métodos cinéticos basados en reacciones con vidas medias mayores a 1 O s, pueden efectuarse en un espectrofotómetro ordinario equipado con compartimiento de celda y dispositivos para introducir y mezclar muestras y reactivos. Las velocidades de reacción dependen en gran medida de la temperatura, por lo que es necesario controlarla en alrededor de 0.1 oc para tener una buena reproductibilidad. En muchos espectrofotómetros comer– ciales hay aditamentos que permiten alcanzar ciertas velocidades. En el caso de reacciones muy lentas, la introducción y la mezcla de la muestra pueden llevarse a cabo antes de poner la mezcla de reacción en el compartimiento de la celda. Se cuenta con una celda estacionaria en la que se colocan todos los reactivos, excepto uno. El reactivo que se requiere para iniciar la reacción es introdu– cido por una jeringa o pipeta y la reacción resultante se supervisa mientras la mezcla es agitada. En el caso de los espectrómetros de un solo canal, la reacción se vigila a una sola longitud de onda midiendo la absorbancia en función del tiempo. Los instrumentos equipados con detectores en serie facilitan la toma de espectros enteros a diferentes tiempos para analizarlos después. Los métodos de flujo continuo, como el análisis por inyec– ción de flujo (véase el capítulo 33), también se utilizan para con– trolar la introducción y reacción de la muestra. Un método de gran aceptación con inyección de flujo es introducir la muestra Simulación: Aprenda más acerca de los métodos cinéticos en www.tinyurl.comjskoogpia 7* 'Este material se encuentra disponible en inglés. 21 Para conocer las condiciones necesarias para que la reacción de una enzima ocurra en su etapa inicial refiérase a J. D. Ingle Jr. y S. R. Crouch, Anal. Chem., 1971, 43, p. 697, DO!: 10.1021/ac6030la007.